复制与转录激活子：治疗KSHV感染性疾病的新靶标

刘晓园，刘晓辉

1辽宁医学院第一附属医院，辽宁锦州 121001；2天津中医药大学中医学院，天津 300193

复制与转录激活子：治疗KSHV感染性疾病的新靶标

刘晓园1，刘晓辉2

1辽宁医学院第一附属医院，辽宁锦州 121001；2天津中医药大学中医学院，天津 300193

卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)引起艾滋病相关恶性肿瘤卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma，KS)、B淋巴细胞增生性疾病原发性积液淋巴瘤和多中心的淋巴结增生症。KSHV感染会经历潜伏和裂解性复制两个互相转换的阶段，而裂解阶段病毒的复制造成感染在组织中的散播，加速肿瘤恶化。由KSHV开放阅读框ORF50编码的复制与转录激活子(replication and transcription activator，RTA)是控制KSHV从潜伏向裂解复制转变的开关，并影响KS的病理进程，有望成为治疗KSHV感染性疾病的新靶标。

卡波西肉瘤；疱疹病毒；复制与转录激活子

卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)又称为人类8型疱疹病毒，与EB病毒、松鼠猴疱疹病毒同属于γ2型疱疹病毒。初次感染时KSHV利用病毒编码的酶系统进行DNA复制、裂解宿主细胞并释放子代病毒颗粒。感染激活了宿主的抗病毒免疫反应，KSHV受其抑制性调控进入潜伏阶段。绝大多数的潜伏期KSHV基因组形成环状附加体，分散地锚定在宿主染色体DNA上，随染色体DNA一同复制并分到子代细胞来维持感染，此时不产生感染性的病毒颗粒，但可诱导细胞增生、变异；在某些宿主内外环境因素例如缺氧、细胞凋亡或丁酸钠刺激下，KSHV重新激活进入裂解性复制，产生大量的子代病毒，造成感染的迅速扩散、肿瘤的发展和恶化[1-3]。控制KSHV从潜伏感染向裂解复制的转换开关是复制与转录激活子ORF50/RTA[4]。细胞内外环境的改变激活相应信号通路，激活RTA表达，在宿主和病毒蛋白的参与下，RTA激活下游大量裂解期基因，推动KSHV从潜伏向裂解复制转换。本文对ORF50/RTA在控制KSHV潜伏-裂解转换中的核心调控作用、RTA蛋白的结构、RTA对下游裂解基因的激活方式、RTA活性的调节、RTA作为药物干预治疗靶位的意义等方面进行综述，希望对广大研究者有所帮助。

1 ORF50/RTA是控制KSHV由潜伏向裂解复制转换的开关分子

1.1 KSHV的潜伏 KSHV首先感染B淋巴细胞，不久在其中建立终生的潜伏[5-6]。在整个潜伏期，绝大多数病毒基因的表达被关闭，只表达ORF73/LANA、vCyclin、vFLIP、12个MicroRNAs和少量anti-RNA等潜伏期基因，在此期间ORF50/RTA的表达被严格控制。此时KSHV基因组末端被连接上富含GC的重复序列(TRs)，形成环状的染色体外附加体，此附加体被病毒编码的潜伏核抗原LANA结合并锚定在宿主染色体上[7]。LANA是一个磷酸化的蛋白，可以利用宿主的酶系统控制附加体的复制并随细胞分裂进入子代细胞，维持对后代细胞的感染[8-9]。KSHV初次感染B细胞后会短暂地表达裂解期基因，ORF50/RTA率先表达，并激活LANA的表达，随后KSHV利用宿主的Notch信号通路建立潜伏。LANA通过与Notch下游的转录抑制子RBP-Jκ相互作用来抑制ORF50/RTA的表达使病毒保持潜伏[10-11]。重组KSHV病毒细胞感染实验表明，ORF50/RTA启动子区的RBP-Jκ结合位点对于KSHV保持潜伏和感染细胞增生是必需的[12]。

1.2 KSHV的裂解性复制 潜伏感染是KSHV常见的感染方式，通常只有1% ～ 3%的KSHV附加体自发激活进入裂解复制。这种自发的重新激活受到表观遗传学调控，即基于非基因序列改变，如DNA甲基化和染色质构象变化等所导致的定居其中的KSHV附加体的激活进入裂解复制[13]。在经历较长时间的潜伏后，KSHV附加体也可以被缺氧、炎性细胞因子、氧自由基、HIV感染、TLRs活化、细胞凋亡等内源因素激活，也可以被外源的裂解激活剂佛波酯和丁酸钠激活进入裂解复制。在此阶段LANA的表达和功能受抑制，KSHV基因组呈线性并有大量复制产生子代病毒颗粒，通过MEK/ERK、JNK、p38、AP-1、Ets-1、HIF1/2、PKC和Notch等信号通路激活蛋白ORF50/RTA的表达。ORF50/ RTA是潜伏-裂解转换的开关分子，随后RTA与多种细胞蛋白(例如RBP-Jκ、Oct-1、C/EBPα等)和病毒蛋白(Mta、K-bZIP)相互作用，激活下游多个KSHV早期基因和晚期基因表达。这些基因包括参与病毒基因转录和基因组复制的重要调节蛋白ORF57/Mta、K-bZIP，还包括vIL-6、多聚腺苷酸化的核RNA(Pan)、vIRF1(ORF-K9)、ORF-K1、小病毒衣壳蛋白(ORF65)、ORF56、SOX(ORF37)、vOX和ORF52等调节基因和结构蛋白基因。RTA也激活自身ORF50/RTA启动子正反馈放大RTA反应。细胞转染实验表明，单独激活ORF50/RTA的表达足以打破潜伏并诱导裂解基因的表达，推动KSHV进入裂解复制；而删除ORF50/RTA基因导致病毒无法重新激活和裂解性DNA复制[14]。

2 ORF50/RTA的结构和功能

2.1 RTA的分子结构 RTA由KSHV ORF50编码，mRNA长3.6 ～ 3.8 kb，与K8等基因一起转录。成熟的RTA蛋白由691个氨基酸残基组成，理论分子量为73.7 kU；而在凝胶电泳中RTA的表观分子量通常为90 ～ 110 kU，还可以更高分子量(300 kU)迁移，这是RTA在体内被PARP-1/hKFC多聚核糖基化和磷酸化修饰的结果。RTA翻译成熟后在细胞质中往往形成多聚体，而四聚体是其活性形式。RTA的N末端的七聚亮氨酸重复区(LR，aa244-275)与中央区(aa245-414)共同介导RTA亚基的相互作用和多聚体的形成，其中LR中富含的脯氨酸成分决定着RTA的多聚化状态[14]。用GCN4或p53的异源多聚化区替换LR区，形成的RTA突变体仍能形成四聚体，并能激活靶基因转录和病毒复制。不能形成四聚体、但能形成更高级多聚体的RTA突变体的转录激活功能减退或失去功能。

通常把RTA的DNA结合结构域定位在N末端aa1-272，也有报道说N末端aa1-72对于结合DNA是非必需的。由于RTA经常与不同的蛋白形成复合物来识别和结合异质性靶序列，因亲和序列的异质性，RTA的DNA结合结构域的位置会有轻微的移动。C末端的aa273-691是RTA的转录激活结构域，有报道把转录激活结构域精确定位于aa527-634[15]。RTA分子上存在着众多的细胞蛋白和病毒蛋白相互作用区，通过与多种蛋白的相互作用，RTA可以识别和激活异质性的启动子来实现对下游靶基因的激活，极大地拓展了RTA的转录激活潜能和调控作用，与转录共激活子/抑制子的相互作用区几乎都在aa273-691范围内[14,16-17]。RTA结合细胞转录共激活子Oct-1、C/EBPα和RBP-Jκ的区域分别位于aa134-150、aa151-170和aa170-400；aa414-530还可以促进RBP-Jκ对DNA的结合； aa607-626结合细胞转录因子STAT3并诱导其二聚体的形成； RTA结合病毒调节蛋白ORF57/Mta、K-bZIP的区域则分别位于aa246-484和aa499-550。RTA还利用aa273-544和aa170-246分别与抑制蛋白性蛋白IRF-7和TLE2相互作用； aa1-272和aa621-641结合细胞蛋白K-RBP，并促进K-RBP的降解；RTA的aa538-554富含Ser/Thr的序列是核糖基化和磷酸化修饰的靶位，这种修饰是抑制性的，而aa448-547是RTA与修饰酶PARP-1/hKFC的结合区。RTA自我抑制区位于aa490-535，抑制自身对DNA的结合； 泛素E3连接酶活性区位于aa118-207，可以促进抑制蛋白IRF-7、K-RBP的泛素化并利用蛋白酶体途径降解，引发RTA自身的泛素化降解； 自我寿命调节区位于aa590-650，调节蛋白丰度，促进RTA的降解。

2.2 RTA对下游裂解基因激活的模式 依据RTA靶基因中RTA应答元件(RTA responsive elements，RRE)的序列同源性和共激活子的不同，RTA激活裂解基因主要通过两种方式： 1)RTA直接结合DNA，激活转录不依赖于RBP-Jκ。例如PAN、K12和KSHV复制起点ori-Lyt(L)处的RTA应答性的启动子，这类启动子被RTA直接结合和激活，含有保守的RRE； 2)通过与细胞转录共激活子相互作用来激活，同时还需要RBP-Jκ的参与。RTA可以利用其他机制激活启动子，例如A可以利用干扰素刺激应答元件(ISREs)激活K14-ORF74启动子。RTA还可通过刺激STAT3二聚化和核定位来激活转录。在KSHV全基因组序列中筛选RTA的结合位点，发现RTA结合的一致序列为TTCCAGGAT(N)0-16TTCCTGGGA，其核心序列恰恰是CANT。在感染期间RTA具备广泛地激活多种基因的潜能，这不仅包括KSHV裂解期基因，也包括多个宿主基因。但在感染期间RTA直接结合和激活启动子是被严格限制的，大多数情况是与其他转录因子相互作用间接激活的方式，这表明感染期间KSHV与宿主广泛地相互作用，并受宿主调控[18]。

3 ORF50/RTA活性的调节

3.1 RTA活性受共价修饰调节 RTA受糖基化和磷酸化修饰使其活性被抑制。RTA富含Ser/Thr区在体内先受到O-连接的N-乙酰葡萄糖胺糖基化修饰，Thr-366/Thr-367是主要的修饰靶位，这种糖基化修饰促进了RTA更广泛的多聚-ADP核糖基化修饰，引进的负电荷阻止了活性RTA四聚体的形成[19]。PARP-1还是细胞营养状态感受器，因此KSHV可以通过对细胞代谢状态的持续观察来调控RTA活性，从而控制裂解基因表达和病毒激活。

3.2 RTA活性和寿命的自我调节 RTA蛋白含有两个独立的区域分别调节DNA结合活性和蛋白丰度。aa520-535区域抑制RTA结合DNA，防止RTA对高亲和力的PAN启动子的过度激活。aa590-650使RTA不稳定，参与RTA的自身泛素化修饰和降解。RTA的寿命还受病毒产物的调控。以ORF50/RTA的反义链为模板转录出一条长3.0kb(T3.0)的多聚腺苷酸化的RNA，过去曾被认为是非编码RNAs，现发现它编码一条含48个氨基酸的短肽，命名为病毒小肽-1(vSP-1)，与RTA蛋白内部的丰度调节基序(PARS)相互作用，这种vSP-1/RTA相互作用阻止了泛素-蛋白酶体途径对RTA的降解，因此vSP-1促进了KSHV的裂解基因表达和病毒复制[20]。

3.3 RTA活性受病毒共激活因子调节 RTA对不同启动子的特异性激活除了受众多宿主蛋白如RBP-Jκ、Oct-1、C/EBPα、AP-1等调节外，还受病毒蛋白的调节，例如ORF57/Mta和K-bZIP。Mta是KSHV从潜伏中激活和裂解性DNA复制所必需的，并协助新生RNA的转录后修饰和向核外输出。Mta可作为RTA的协同激活因子来激活下游裂解基因转录。但Mta本身不能直接激活转录，只是作为RTA的辅助因子刺激转录。K-bZIP对RTA的功能有双向调节作用，研究发现K-bZIP不但与RTA协同激活19个KSHV启动子，还抑制RTA激活另外的3个启动子；宿主的RTA结合蛋白(K-RBP)对RTA活性也有双向调节作用，在低浓度时协同RTA激活ORF57/Mta、K-bZIP、vIL-6、ORF50/RTA和vMIP-1启动子，在高浓度时却抑制RTA对ORF57/Mta、K-bZIP和PAN启动子的激活，K-RBP在ORF57/Mta启动子的结合位点为富含GC序列，此位点与RBP-Jκ位点和CANT序列重叠。

3.4 RTA活性受转录抑制因子调节 病毒感染可刺激宿主产生大量IFNα/β来抑制病毒复制。而干扰素信号分子IRF-7能与RTA竞争结合ORF57/Mta启动子的RRE位点来抑制RTA对ORF57的激活，从而抑制RTA对病毒裂解基因的激活[21]。另一种细胞蛋白NF-κB(RelA)也抑制RTA和RBPJκ对启动子的结合和转录激活，并抑制RTA与RBP-Jκ的相互作用，但这种抑制是启动子特异性的。这暗示着高水平的NF-κB通过抑制RTA来促进KSHV的潜伏。转导蛋白样拼接增强子(trasducin-like enhancer of split，TLE)-2可以结合RTA的aa170-246，并抑制RTA与RBP-Jκ的结合。研究发现TLE-2通过下调RTA对ORF50/RTA、PAN、K-bZIP和ORF59启动子的激活来抑制RTA介导的病毒重新激活。RTA也发展出对付抑制性蛋白的策略，RTA具备的E3连接酶活性可以促进与之结合的转录抑制子IRF-7和K-RBP的泛素化修饰而降解。此E3连接酶活性区位于富含Cys-His区。

4 RTA是细胞内外环境调控KSHV裂解复制的作用靶标

在寄生生活中KSHV获得了对多种细胞内外环境变化的应激反应，并巧妙地利用胞内信号来决定进入潜伏或裂解复制。RTA通过与多种细胞和病毒蛋白相互作用来调控KSHV潜伏或裂解周期基因的转换，是细胞内外环境调控KSHV复制周期的作用靶标。促进细胞生存和生长的途径会促进KSHV的潜伏，凋亡则会激活KSHV进入裂解复制。细胞求生途径的信号分子NF-κB可以抑制KSHV裂解复制，这是通过NF-κB对RBP-Jκ的拮抗作用，下调RTA的表达和功能来实现的。组织缺氧会诱导缺氧诱导因子(HIF1/2)的积累，而ORF50/RTA启动子含有缺氧应答元件(HREs)并对HIF-2α应答。因此缺氧通过激活ORF50/RTA表达促进病毒进入裂解复制，而KSHV感染也会诱发组织缺氧和HIFs水平的提高。最近有报道表明，缺氧和缺氧诱导因子(HIF1/2)可同时诱导潜伏相关基因例如LANA和裂解基因的表达，HIF1α与RTA相互作用，并促进RTA对LANA启动子LTi的激活[22]。在缺氧条件下，LANA对ORF50/RTA启动子的抑制也通过与HIF-1α相互作用转变成激活作用。临床上观察到KS肿瘤经常出现在血氧供应较低的部位如手臂和脚，研究发现缺氧可以在培养的PEL细胞中诱导KSHV裂解复制。缺氧环境也会诱导X-盒结合蛋白(XBP-1)，与HIF-1α协同激活RTA启动子诱导KSHV裂解复制。

HIV感染PEL细胞促进KSHV裂解复制，而HIV转录激活子Tat完全能诱导RTA的表达和KSHV裂解复制，临床上也发现AIDS型KS肿瘤具有比其他KS肿瘤恶性程度更高的表型。特殊的细胞周期和细胞分化也会调节KSHV的激活，XBP-1除了能与HIF-1α协同激活RTA启动子，也能独立激活ORF50/RTA启动子启动KSHV裂解复制。TPA和丁酸钠也会诱发潜伏的KSHV进入裂解复制。这些因素还可以激活Ets-1、PKC和Notch信号通路，通过其下游的转录因子RBP-Jκ、C/EBPα与病毒蛋白RTA、ORF57/MTA和K-bZIP相互作用，迅速移除KSHV基因组上的抑制性组蛋白标签，并激活下游裂解基因的表达。例如MEK/ERK、JNK和p38 MAPK途径都可以激活AP-1，而ORF50/RTA启动子含有功能性的AP-1结合位点。研究表明KSHV的自发活化或TPA诱导的激活就是通过Raf/MEK/ERK/Ets-1途径的下游转录因子AP-1激活ORF50/RTA、ORF57/MTA、K8/ K-bZIP的表达来实现的。染色质结构的改变会激活ORF50/ RTA的表达从而激活KSHV附加体。潜伏期KSHV附加体的LANA所在的潜伏控制区和ORF50/RTA所在的裂解性转录控制区被染色质组构蛋白CTCF和Cohesin连接到一起并固定在染色体上，而Cohesin是KSHV裂解期基因的主要抑制物。这种连接是外源裂解激活剂丁酸钠的作用靶标，丁酸钠抑制了组蛋白脱乙酰基酶，造成了裂解性转录控制区的染色质的活化，激活ORF50/RTA表达诱导KSHV由潜伏向裂解复制转换[23]。破坏DNA上CTCF和Cohesin的结合位点或人为耗尽CTCF和Cohesin的亚基将破坏染色质的连接并增加ORF50/RTA转录物的水平，从而激活KSHV裂解复制。

5 抑制ORF50/RTA表达和活性是治疗KSHV感染性疾病的新靶标

KSHV的裂解复制促进KSHV感染的扩散，加速了KS病理进程。KS的临床影像结合病理切片检测结果表明，裂解期病毒编码的vIL-6(人IL-6的同源物)在高表达时，促进感染细胞的生长、转化，防止感染细胞凋亡，维持肿瘤的血管生成表型并加速肿瘤恶化[24-25]。因此抑制体内潜伏KSHV的裂解复制有望延缓疾病的发展。临床上已经有报道用丙氧鸟苷抑制KSHV的复制降低了感染HIV病人的KS发生率[26]。那么还有哪些途径可以抑制KSHV的复制呢？抑制ORF50/RTA的表达和活性成为一个可能的方式。

以下的研究和临床实践让我们看到了一线曙光：1)直接抑制ORF/RTA的表达。已有报道说构建了拮抗ORF50/ RTA mRNA的肽偶联-反义PMO (P-PMO)。P-PMO与单链DNA结构相似，约20个碱基长度，但以吗啉环替代脱氧核糖，以磷酸二酰胺键替代磷酸酯键，可以对抗核酸酶消化，在PEL细胞中拘捕RTA mRNA，利用空间位阻阻止翻译起始。PMO序列特异性P-PMO可以结合RTA的mRNA，结果表明RP1 P-PMO能特异性阻断KSHV复制[27]。2)间接抑制ORF50的表达。临床上一些药物可通过间接方式抑制KSHV从潜伏中激活和肿瘤形成。例如非毒性剂量的葡萄糖类似物2-脱氧-d-葡萄糖(2-DG)能刺激内质网压力，关闭eIF2a活性，其中RTA基因、糖蛋白B、K8.1和血管生成调节基因的表达都被2-DG下调；新近发现一种称为白藜芦醇的食品添加剂能通过降低转录因子ERK1/2活性和生长应答因子-1(Egr-1)的表达来抑制感染细胞中的KSHV激活进入裂解复制[28-29]。生长应答因子-1(Egr-1)是Raf＞MEK＞ERK1/2下游信号成分，而ORF50/RTA是Egr-1的作用靶标；用氨甲蝶呤下调ORF50表达将抑制KSHV从潜伏向裂解的转换，阻断RTA的表达和活性也减缓了KSHV感染和肿瘤发展，但药物毒性的降低需要慎重考虑[30-31]。

作者提出的方案是：直接抑制ORF50的表达。目前已有靶向RNA干扰(RNAi)的慢病毒载体的构建抑制目标基因的表达和功能在细胞实验中取得成功，慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒HIV改建而来，由于其具有可感染非分裂细胞和分裂期细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小，作用持久等优点，具有更高的安全性。构建ORF50基因RNAi的慢病毒载体用于体内基因治疗，在体内直接抑制RTA表达和功能、KSHV的裂解复制，有望成为治疗KSHV感染性疾病的理想方案[27,32-33]。

6 结语

ORF50/RTA在KSHV生命周期中发挥着核心的调控作用。抑制KSHV从潜伏中激活，并抑制裂解基因的表达，有望成为延缓KS增生疾病发展和控制肿瘤恶化的一条潜在途径，而抑制ORF50表达和RTA活性成为治疗此类疾病的潜在靶点，开发抑制ORF50表达，或抑制RTA活性的低毒性药物成为新的研究方向，但更深入的研究工作需要展开。

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Replication and transcription activator: A new target for treatment of infectious diseases caused by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus

LIU Xiao-yuan1, LIU Xiao-hui2
1First Affiliated Hospital of Liaoning Mediacal College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin university of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
Corresponding author: LIU Xiao-hui. Email: liuxiaohui74@126.com

Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is the pathogen of AIDS-related malignant Kaposi's sarcoma (KS), B-lymphocyte proliferation diseases and multicentric Castleman's disease (MCD). Infection with KSHV includes latent infection stage and lytic replication stage. KSHV in lytic replication causes spread of infection in tissues and exacerbates the growth of KS. Replication and transcription activator (RTA) coded by KSHV open reading frame 50 (ORF50) is the key regulatory factor to control the switch of KSHV from latent infection into lytic replication and is involved in multiple aspects of KS pathological process. RTA is hoped to become a new target for the treatment of infectious diseases caused by KSHV.

Kaposi sarcoma; herpesvirus; replication and transcription activator

R 511

A

2095-5227(2014)06-0641-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.06.035

2014-02-28 16:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140228.1639.001.html

2013-10-14

美国国立卫生院海外项目(1R01)

Supported by NIH Grant(1R01)

刘晓园，男，在读硕士。研究方向：影像医学与核医学。Email: lxy632@163.com

刘晓辉，男，博士，讲师。Email: liuxiaohui74@126.com