血管内皮生长因子165b抑制肿瘤血管生成的研究进展

谷 芳，李秀丽，姚元庆

解放军总医院 妇产科，北京 100853

血管内皮生长因子165b抑制肿瘤血管生成的研究进展

谷 芳，李秀丽，姚元庆

解放军总医院 妇产科，北京 100853

研究认为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因差异剪接后能够产生促进血管生成的VEGFxxx和抑制血管生成的VEGFxxxb。在VEGFxxxb家族中，VEGF165b在功能上具有代表性地位，表现出明显的抑制VEGF165所介导的血管生成作用。由于VEGF165b具有机体自然产生、不具有免疫原性的优势，有望通过强制高表达、外源性给予重组蛋白或促进VEGF外显子8b选择性剪接抑制肿瘤血管生成，从而用于肿瘤的治疗。

血管内皮生长因子165b；血管内皮生长因子；抗血管生成；肿瘤

肿瘤的生长离不开新生血管的生成，血管生成是促血管生长因子与抑制因子相互协调、促血管生长因子增多的结果。在血管生成研究中，研究最广泛的是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。由于VEGF mRNA剪接位点的选择性差异，VEGF产生了多种形式的VEGF剪接变异体：有促进血管生成的VEGFxxx家族和抑制血管生成的VEGFxxxb家族，在VEGFxxxb家族中，VEGF165b无论是在功能还是在体内分布上都占有主导地位[1]。2002年Bates等[2]首次从肾小球上皮细胞中分离出VEGF的一种新型剪接变异体-VEGF165b，因为显示出抑制VEGF165所介导的血管生成作用而受到广泛关注。

1 VEGF165b的结构和功能

VEGF基因位于染色体6p21.3，由8个外显子构成，并因剪接位点的选择性差异产生了多种形式的VEGF剪接变异体，各自按其氨基酸的数目进行命名[3]。VEGF165b由7个外显子组成，缺少外显子6。外显子l编码信号肽序列，该序列后来被信号肽酶切除而最终只形成165个氨基酸肽链；外显子2编码肽链的N端结构；外显子3、4编码的肽链可识别VEGF的受体VEGFR1和VEGFR2；外显子5编码的肽链可以激活纤维蛋白溶酶；外显子7编码的肽链可结合肝素及NRP-1和NRP-2；外显子8b编码VEGF165b羧基末端特有的6个氨基酸。VEGF165与VEGF165b具有相同的氨基酸数目，两者的区别仅在于氨基酸组成中羧基末端由外显子8编码的6个氨基酸的不同。由于选择性剪接发生在外显子8的近端剪接位点(proximal splice site，PSS)，VEGF165羧基末端的6个氨基酸为CDKPRR(Cys-Asp-Lys-Pro-Arg-Arg)，而VEGF165b的选择性剪接发生在外显子8的远端剪接位点(distal splice site，DSS)，其羧基末端6个氨基酸则为SLTRKD(Ser-Leu-Thr-Arg-Lys-Asp)[4]。随后又有实验研究证实了其他亚族在DSS位点剪接后也产生了相应的抑制性VEGFxxxb亚族，包括有VEGF121b、VEGF145b、VEGF111b、VEGF183b和VEGF189b[5-7]。

2 VEGF165b的抑制肿瘤血管生成功能

肿瘤体积＞1 mm3时，肿瘤组织内部组织液交换不能提供足够的营养物质以维持肿瘤细胞的生长和转移，使得肿瘤细胞通过激活缺氧诱导因子1信号转导通路诱发肿瘤血管生成。肿瘤血管生成包括新血管出芽、血管扩张和血管通透性改变、内皮细胞黏附以及骨髓衍生的内皮前体细胞掺入等过程[8]。在VEGF剪接变异体中，VEGF165显现出最强的促血管生成作用，在黑素瘤、结肠癌和膀胱癌等肿瘤组织中过量表达；相反，VEGF165b在肿瘤组织中表达下降，而在正常组织中的表达占优势，如在后根神经节、肺、结肠、皮肤和玻璃体中占VEGF总量的比例分别为71%、82%、95%、95%和66%，胎盘组织则是唯一特例仅为1.4%，VEGF165b表现出抑制VEGF165所介导的肿瘤血管生成的作用[9-11]。

Bates等[2]使用RT-PCR技术研究肾细胞肾癌时，首次从肾小球上皮细胞中分离出内源性剪接变异体VEGF165b，并发现其能以剂量依赖方式显著抑制VEGF165介导的内皮细胞增殖、迁移及肠系膜动脉扩张。此后，该研究小组发现，在前列腺癌细胞中VEGF165表达下调，在前列腺癌细胞移植瘤模型中，稳定转染VEGF165b的肿瘤与表达VEGF165的肿瘤相比生长速度显著降低[12]。Rennel等[13]使用荷瘤小鼠进行研究表明，强制高表达VEGF165b不仅能显著抑制前列腺癌、Ewing肉瘤和肾细胞癌等生长，而且能够显著抑制肿瘤细胞对血管内皮细胞的促迁移和促增殖作用。该研究小组在后续研究中发现，皮下注射重组VEGF165b蛋白通过直接抑制内皮细胞出芽、分裂方向及血管环结构形成，显著抑制结肠癌生长并降低癌组织微血管密度；静脉注射125Ⅰ-VEGF165b表现出显著的肿瘤持久摄取至少持续24 h，并且对肝功能及血流动力学无不良影响，为重组VEGF165b蛋白作为肿瘤抗血管治疗方法奠定了基础[14]。Afkhami等[15]将稳定转染VEGF165b的HEK293细胞封装在海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊里，种植在裸鼠肿瘤周围，发现肿瘤周围的血管数量明显减少。

3 VEGF165b抑制肿瘤血管生成的分子机制

VEGF165羧基末端的6个氨基酸为CDKPRR，而VEGF 165b则为SLTRKD。VEGF165b在氨基酸序列上与VEGF165相比，第160位点的半胱氨酸被丝氨酸取代，不能与146位点的半胱氨酸形成二硫键，导致其蛋白质三维结构发生改变[16]。Jia等[17]在实验中证实，外显子8编码的羧基末端氨基酸组成和半胱氨酸的丢失造成了VEGF165和VEGF165b在结构、受体相互作用和生物学活性等方面出现差异。

VEGF165、VEGFR2和辅助受体NRP-1结合能够诱导VEGFR2构型变化，使得其胞内作用域发生旋转，并且在受体二聚体化后使激酶作用域向二聚体内部旋转，引发酪氨酸自磷酸化；NRP-1作为VEGFR2的复合受体，具有增强VEGFR2发挥生物学效应的作用，VEGF165b虽然能与VEGFR2结合，但并不能与NRP-1结合，最终使得VEGFR2不能产生充分的旋转效应，致使自磷酸化效率降低[18]。也就是说，VEGF165b是VEGFR2的部分激动剂，仅能短暂而微弱地激活VEGFR2及其下游的信号分子，从而起到抑制VEGF165介导的促进内皮细胞增殖、迁移和血管生成作用。Freitas-Andrade[19]领导的团队研究显示，VEGF165和VEGF165b分别与VEGFR2结合后诱发的酪氨酸磷酸化位点存有差异，磷酸化肽位定位和位点特异性磷酸化抗体实验结果显示VEGF165b仅能部分激活VEGFR2受体，但因扭转不足而不能磷酸化位于激酶调节位点的第1 054位酪氨酸，致使激酶的ATP结合位点快速关闭和激酶的迅速失活，从而仅能一过性引发较弱的ERK1和ERK2磷酸化效应。而VEGF165不仅能通过磷酸化第1 054位酪氨酸持续激活ERK1/2，还能通过磷酸化第1 175位酪氨酸激活磷脂酶Cγ和PI3K、促进二酰基甘油生成，并能通过蛋白酶C依赖、Ras非依赖方式激活Raf/MEK/ERK信号转导通路，最终促进内皮细胞迁移和新血管生成。

4 VEGF165b在肿瘤治疗方面的展望

肿瘤的生长离不开新血管的生成，而VEGF起到了诱导和促进血管生成的关键作用。因此，抗血管生成治疗成为临床肿瘤治疗中一个新的、有效的治疗手段。现有抗血管生成制剂多以VEGF-A或其受体作为分子靶点[20]。当前用于卵巢癌治疗的抗血管生成制剂的作用机制包括封闭或阻断VEGF-A与其受体结合、抑制受体酪氨酸酶激活或阻断其下游效应分子以及破坏肿瘤血管等，但这些抗血管制剂都存在肠道穿孔、高血压和蛋白尿等严重不良反应，限制了这些药物在临床上的应用[21]。Konopatskaya等[22]对小鼠视网膜新生血管生成的研究中发现，VEGF165b可明显抑制视网膜前新生血管生成，而对生理性视网膜内血管生成无抑制作用。这一点有待于进一步研究，如果对生理性血管没有影响，就更加显示出VEGF165b对于当前应用的抗血管生成制剂所具有的优越性。

VEGF165b具有显著地抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长的作用，我们可以通过强制高表达VEGF165b、给予外源性重组VEGF165b或促进VEGF外显子8b选择性剪接抑制肿瘤血管生成，从而达到治疗肿瘤的目的[23-24]。目前对VEGF165和VEGF165b的选择性剪接调控机制的研究结果表明，多种信号途径可影响终末端外显子的剪接位点，生长因子TGF-β1通过p38 MAPK-Clk/sty激酶选择外显子8的远端剪接位点，从而产生具有抗血管生成作用的VEGF165b家族，而这些过程可能是分别通过剪接因子SRp55产生作用[16]。

5 结语

VEGF165b表现出明显的抑制肿瘤血管生成的作用，从而抑制肿瘤的生长。VEGF165b用于肿瘤的抗血管生成治疗，其优势在于由机体自然产生、不具有免疫原性、对生理性血管没有影响，具有重要的临床应用价值。

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Advances in inhibitory effect of VEGF165b on tumor angiogenesis

GU Fang, LI Xiu-li, YAO Yuan-qing
Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

YAO Yuan-qing. Email：yqyao@126.com

VEGF can result in angiogenesis-stimulating VEGFxxx isoforms and angiogenesis- inhibiting VEGFxxxb isoforms after the VEGF gene is differentially spliced. The function of VEGF165b has the representative position in the VEGFxxxb family. The VEGF165b plays an important role in inhibiting tumor angiogenesis due to its advantages of natural body production and nonimmunogenicity, and can thus be used in treatment of tumor by up- regulating the over-expression of exogenous recombinant protein or promoting the alternative splicing of VEGF exon 8b.

vascular endothelial growth factor 165b; vascular endothelial growth factor; anti-angiogenesis; neoplasms

R 730.23

A

2095-5227(2014)07-0770-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.035

时间：2014-03-07 11:12

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140307.1112.003.html

2014-02-13

国家自然科学基金项目(81250030)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81250030)

谷芳，女，博士。研究方向：妇科肿瘤。Email：gufang301@163.com

姚元庆，男，主任医师，教授，博士生导师。Email：yqyao@126.com