产超广谱β－内酰胺酶多重耐药的肺炎克雷伯菌相关基因研究

李瑞蓉 李连青 李浩 高亚静 陕柏峰 崔雪萍 王春芳

产超广谱β－内酰胺酶多重耐药的肺炎克雷伯菌相关基因研究

李瑞蓉 李连青 李浩 高亚静 陕柏峰 崔雪萍 王春芳

目的 了解山西地区五家医院多重耐药的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）的耐药特点，并研究其产超广谱β－内酰胺酶（extended spectrumβ－lactamaes，ESBLs）多重耐药的KP相关基因的流行情况。方法收集2010年1月－2012年12月山西地区五家医院临床标本中分离的KP 2516株，采用药敏试验（K－B法）和ESBLs确证实验筛选多重耐药的KP，采用PCR法扩增ESBLs多重耐药的KP相关基因，选取阳性产物进行测序并在Genbank进行分析。结果2516株KP中，筛选出40株产ESBLs的多重耐药KP。PCR法基因扩增检测出40株blaTEM型，1株SHV型和4株KPC型；检测出染色体介导的GyrA型32株，质粒介导的qnrA型8株，qnrB型15株，以及qnrS型2株；没有检出金属酶NDM－1基因。结论多重耐药的KP耐药机制非常复杂，多重耐药菌株的出现导致同一菌株中同时携带几种基因。因此，应加强临床病例的监测，合理使用抗菌药物，减少泛耐药菌株的传播。

肺炎克雷伯菌；多重耐药；超广谱β－内酰胺酶；基因型

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是医院引起感染的常见病原菌，根据全国细菌耐药性监测网数据［1，2］显示，临床标本分离出的菌株中，KP在所有分离菌中排名第三位。主要原因是近二十年来抗生素素在临床的不规范使用导致KP耐药的现象日趋严重，从而引发细菌的多重耐药问题。本文研究收集山西地区五家三甲医院的多重耐药的KP，对相关基因进行分析研究。

1 材料与方法

1.1 菌株来源收集2010年1月－2012年12月山西省不同地区五家三甲医院（山西医科大学第一临床医学院，山西省医科大学第二临床医学院，山西省人民医院，临汾市第一人民医院及长治市和平医院）临床分离的2516株KP。标本来源科室主要为呼吸科、神内科、ICU、血液科、肿瘤科和放疗科。所有菌株均于－70℃保存。

1.2 仪器与试剂菌株鉴定用法国梅里埃API20E鉴定板，药敏纸片和产超广谱β－内酰胺酶（extended spectrumβ－lactamaes，ESBLs）确证纸片均购于英国Oxiod公司。DNA提取和PCR扩增试剂为北京生物工程公司产品。主要仪器为生物安全柜（BIOBASE），电热恒温培养箱（德国贺利斯公司），高压灭菌锅（HIRAYAMA），－70℃低温冰箱（日本SANYO公司），电子天平（上海奥豪斯国际贸易有限公司），高速离心机和微量加样器（德国Eppendorf），PCR扩增仪（上海BIONEER柏业贸易有限公司），水平凝胶电泳槽（上海复生生物工程研究所），Bio－RAD紫外线透射拍照系统（意大利BIORAD）。

1.3 药敏试验及ESBLs确证实验药敏试验采用K－B纸片法。ESBLs确证实验依据2009年CLSI推荐标准方法，同时使用头孢他啶（30μg）和头孢他啶／克拉维酸（30／10μg），头孢噻肟（30μg）和头孢噻肟／克拉维酸（30／10μg）两对药敏纸片，当两种药物中有任何一个在加克拉维酸后抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环直径相比增大值≥5mm，可确认为ESBLs菌株。质控菌株KPATCC70063、大肠埃希菌ATCC25922均购于卫生部临床检验中心。

1.4 PCR模板制备采用煮沸法提取模板，用接种环挑取血琼脂培养基上2～3个单个的新鲜菌落置于内含200μl双蒸水的1．5ml离心管中。振荡3 s混匀后，沸水中煮15min，以离心半径3 cm，10 000 r／min离心5min，吸取上清液作为DNA模板，－20℃冰箱保存备用。

1.5 引物序列根据引物设计软件premier 5．0确定引物序列，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，PCR扩增基因型及引物序列见表1。反应体系F（20μmol／L）1μl和R（20μmol／L）1μl，10×buffer为2μl，dNTP（10mol／L）为1μl，MgCl2（25 mmol／L）1．2μl，Taq酶1 U，模板DNA 2μl，补足纯水至20 μl。TEM、SHV、KPC型反应条件为94℃预变性5 min，然后94℃变性60 s，52℃退火60 s，72℃延伸60 s，30个循环，最后72℃延长10min。GyrA、qnrA、qnrB和qnrS反应条件为94℃预变性2min，然后94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环，最后72℃延长5min。NDM－1型反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性15 s，退火30 s（引物1退火温度55℃，引物2退火温度60℃），72℃延伸30 s，25个循环，最后72℃延长5min。

表1 PCR扩增基因型及引物序列

2 结果

2.1 药敏试验结果2516株KP中共检出40株多重耐药KP菌株。ESBLs确证实验结果显示，40株多重耐药的KP全部为ESBLs菌株。

2.2 PCR扩增基因分型40株多重耐药的KP中，全部扩增出TEM基因型，扩增率为100．0%；1株扩增出SHV型，扩增率为2．5%；32株扩增出染色体GyrA，扩增率为80．0%；8株含质粒qnrA型，扩增率为20．0%；15株含质粒qnrB型，扩增率为37．5%；2株含质粒qnrS型，扩增率为5．0%；4株扩增出KPC基因型，扩增率为10．0%；没有菌株扩增出NDM－1型，结果见表2。TEM型、GyrA型、qnrA型和KPC型PCR产物电泳图见图1～图4。

3 讨论

KP属于肠杆菌科一种重要的条件致病菌。在引起医院感染的条件致病菌中占有非常重要的地位，由于抗生素的广泛应用导致KP出现多重耐药。资料［3］表明，多重耐药的KP主要发生在免疫功能低下、有潜伏性疾病及重症监护的患者中。

表2 40株ESBLsKP的PCR扩增基因分型结果

图1 TEM型PCR产物电泳图

图2 GyrA型PCR产物电泳图

图3 qnrA型PCR产物电泳图

图4 KPC型PCR产物电泳图

本文研究从2010年－2012年山西地区五家医院临床分离的2516株KP中，检测出40株多重耐药的KP，说明KP是造成医院感染的重要致病菌。KP的多重耐药问题引起了医学界的极大关注［4，5］。2008年印度新德里首先从KP中发现了超级细菌金属酶NDM－1［6］。国际上陆续报道在英国、巴基斯坦等国都发现产NDM－1泛耐药肠杆菌科的细菌（超级细菌）。我国也已经发现3例超级细菌。

KP的主要耐药机制是三代头孢抗生素的应用导致ESBLs和头孢菌素酶的出现。ESBLs除了能水解青霉素类、一代头孢和二代头孢抗生素外，还可水解三代头孢抗生素以及单环β－内酰胺酶，甚至第四代抗生素。第四代头孢类碳青霉烯抗生素是目前所使用的抗菌药物中抗菌谱最广、抗菌活性最强的一类抗生素，常作为多重耐药的革兰阴性杆菌的最后一道防线，但目前已经发现ESBLs耐药菌株。ESBLs菌株往往携带氟喹诺酮类、氨基糖苷类等抗生素多种耐药基因，通过接合、转化和转导等形式使耐药基因在细菌间扩散。

对氟喹诺酮耐药的菌株主要与染色体介导的突变有关［7］，但1998年Martínez等［8］在美国的Alabama大学分离到一株多重耐药的KP，及2002年Tran等［9］的研究证实，质粒能介导喹诺酮耐药，质粒介导的耐药能在肠杆菌科和铜绿假单胞菌间传播。2007年土耳其［10］也报道发现了产qnrA的基因。qnr可在不同细菌中迅速水平传播，其引发的感染不易控制，使得院内感染大范围的流行；qnr基因常与其他多种耐药基因共同整合作用，导致临床医生在治疗相关细菌感染时选药或联合用药的空间缩小，亚洲、美洲和欧洲等地相继出现有关报道［11，12］，因此其耐药问题越来越受到人们的关注。

碳青霉烯酶编码基因可以由染色体介导，也可以定位在质粒、整合子等可转移的基因元件上，通过质粒或转座子在不同菌种之间进行传播。碳青霉烯编码的KPC基因自2001年在美国纽约地区报道［13］后，已在全球很多国家和地区出现。Wei等［14］于2007年首次报道了我国KPC型耐药菌株的出现。产KPC酶的菌株主要从ICU，神经内科重症住院患者中分离，而且大部分为肠杆菌科的细菌。

本文研究的40株多重耐药的KP中，PCR扩增结果显示，40株全部扩增出TEM型，4株扩增出KPC型，32株扩增出GyrA型，8株扩增出qnrA型，15株扩增出qnrB型，2株扩增出qnrS型。质粒介导的qnrA、qnrB、qnrS型等耐药基因是ESBLs KP对喹诺酮类抗生素耐药的重要机制。KPC酶是KP对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一，除此之外可能还存在其他耐药机制。本文研究中，山西地区五家医院ESBLs多重耐药的KP基因型以TEM型为主；多重耐药的喹诺酮类耐药基因型qnr主要是qnrA1和qnrB4。没有检测出金属酶NDM－I基因。

另外，本文研究发现5株KP同时存在GyrA、TEM、qnrA和qnrB基因型，说明qnr基因常与其他多种耐药基因共同整合在一起。这与美国学者［11］发现在ESBLs菌株中检出率高可能与质粒携带多重耐药基因相关的结论一致。

本文研究用PCR基因扩增实验证实有4株KPC型菌株。相关报道大多数是由质粒介导的KPC酶，染色体介导的KPC酶很少见。本文研究中的40株多重耐药KP经基因测序及在GenBank数据库中进行比对，发现分离自长治市和平医院的2株KPC型菌株可能是由染色体介导的KP，同源性序列达99%。有报道［15］显示，2007年在铜绿假单胞菌中发现KPC基因型，其基因可能位于染色体上。携带KPC－2型泛耐药的KP容易导致院内感染的流行暴发［16］。另有研究［17］表明，美国及以色列的部分产KPC酶KP中还携带有质粒介导的喹诺酮耐药决定簇qnrA和qnrB。

抗生素的广泛应用导致耐药菌株呈不断上升趋势，多重耐药和泛耐药菌株的出现导致同一菌株中携带几种耐药基因，极大增加了临床治疗的难度。临床医生应合理使用抗生素，加强细菌耐药性监测及医院感染的控制，减少耐药株的产生及传播。

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3 张亚莉，杨云滨，汪能平，等．危重患者医院感染临床调查分析．中华医院感染学杂志，2003，13：120－123．

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17 EndimianiA，Carias LL，Hujer AM，et al．Presence of plasmid－mediated quinolone resistance in Klebsiella pneumoniae isolates possessingblaKPC in the United States．Antimicrob Agents Chemother，2008，52：2680－2682．

The related gene research of multidrug resistance klebsiella pneumoniae producing extended spectrum β－lactamaes

LIRui－rong1，LI Lian－qing2，LIHao3，et al．1Third Hospital of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030006，China2Clinical Laboratory Center of Shanxi Province，Taiyuan 030012，China3The FirstHospitalof ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan 030001，China

ObjectiveTo investigate resistant characteristic ofmultidrug resistance K lebsiella pneumoniae（KP）in the five hospitals of Shanxi province，and to study the related gene prevalence condition of multidrug resistance KP producing extended spectrumβ－lactamaes（ESBLs）in several areas of Shanxi province．Methods2516 strains of KP were isolated in clinical specimens from January 2010 to December 2012．multidrug resistance KPwere detected by drug sensitive test（K－Bmethod）and ESBLs confirmed experiment．The related gene of multidrug resistance KPwas amplified by PCRmethod．The positive productswere selected to sequenced，and the resultswere analyzed on Genbank．ResultsIn 2516 strainsof KP，40 strains ofmultidrug resistence KP producing ESBLswere isolated．The detection of PCR method showed that there were40 strains of TEM type，1 strain of SHV type，4 strains KPC type．Therewere32 strainsGyrA type chromosome－mediated，and 8 strains qnrA，15 strains qnrB，2 strains qnrSof plasmid－mediated．There was no metalenzyme NDM－1 gene detected．ConclusionThe phenomenon of multidrug resistance KP ismuchmore serious and the resistantmechanism is very complex aswell．Multiple resistant strains lead to the same strains thatcarry severalgenes，so themonitoringof clinical casesshould be strengthened and theuseofantimicrobial agentsshould be rationalsoas to reduce the spread of resistantstrains．

Klebsiella pneumoniae；M ultidrug resistance；Extended spectrumβ－lactamaes；Genotype

10．3969／j．issn．1674－7151．2014．01．004

2014－01－20）

（本文编辑：李霦）

国家重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”（2009ZX10004－203）

030006 太原市，山西中医学院第三中医院（李瑞蓉）

030012 太原市，山西省临床检验中心（李连青 崔雪萍）

030001 太原市，山西医科大学第一医院（李浩）

030001 太原市，山西医科大学（高亚静 陕柏峰 王春芳）

李连青，E－mail:sxllq＠tom.com