卵巢癌患者血清miR－200家族和miR－100检测的临床价值

邱振华 王茂生 杨长福 魏凯 杨越红 麦大海

临床研究

卵巢癌患者血清miR－200家族和miR－100检测的临床价值

邱振华 王茂生 杨长福 魏凯 杨越红 麦大海

目的 探讨血清microRNA的表达差异在卵巢癌诊断和治疗中的临床价值。方法收集149例卵巢肿瘤患者和30例健康体检者，采用qRT－PCR检测受检者血清miR－200a、miR－200b、miR－200c和miR－100的表达情况，对检测结果进行统计学分析。结果miR－200a、miR－200b和miR－200c在卵巢癌患者血清中表达水平均高于正常对照者，而miR－100在卵巢癌患者血清中表达水平低于对照组，且差异均有统计学意义（P均＜0．001）。miR－200a、miR－200b、miR－200c及miR－100在良性肿瘤患者与正常对照者血清中表达水平差异均无统计学意义（P均＞0．05）。miR－200a、miR－200b和miR－200c在透明细胞癌的表达水平明显高于浆液性和黏液性癌，且差异均有统计学意义（P均＜0．05）。miR－200b在浆液性癌中的表达水平高于黏液性癌，miR－200c在透明细胞癌中的表达水平高于子宫内膜癌，且差异均有统计学意义（P均＜0．05）。结论血清miR－200家族的表达可用于卵巢癌的诊断、疗效监测及预后评估。

miR－200家族；miR－100；实时定量PCR；卵巢癌

卵巢癌病死率居女性生殖系统恶性肿瘤之首，其发病率有逐年升高的趋势。国内资料［1］显示，从2004年起，卵巢癌已取代子宫内膜癌成为上海市发病率最高的女性生殖系统恶性肿瘤。由于缺乏可靠的肿瘤标志物，且早期缺乏典型的临床症状，约70%的患者发现时已到晚期，因此临床上迫切需要寻找新的肿瘤标志物用于卵巢癌的早期诊断、治疗和预后评估。有研究［2］显示，microRNA与人类疾病的发生发展密切相关，在肿瘤发展的过程中，异常的microRNA表达可以灭活抑癌基因或者激活癌基因，从而促进肿瘤的形成。本文旨在观察血清miR－200a、miR－200b、miR－200c和miR－100在卵巢癌中的差异性表达，探讨将其作为非创伤性肿瘤标志物的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2011年5月至2013年12月我院病房及门诊卵巢肿瘤患者149例。其中，良性肿瘤17例，交界性肿瘤23例，卵巢癌109例；年龄20～85岁，中位年龄42岁，患者均无卵巢癌或其他妇科肿瘤家族史。所有肿瘤患者均经组织病理检查以明确诊断，病理诊断结果见表1。选择同期健康体检妇女30例为正常对照组。

1.2 方法抽取卵巢肿瘤患者及正常对照者外周血5ml，以离心半径20 cm，3000 r／min离心15min，吸取上清液至除酶管内，－70℃保存备用。

总RNA提取：受试者均分别取血清400μl，参照mirVanamiRNA（Ambion公司）提取试剂盒提供的方法提取血清总RNA。

miRNA表达检测：按照TaqMan MicroRNA检测试剂盒（Applied Biosystems公司）说明进行逆转录反应，然后应用real－time qPCR（TaqMan PCRMaster Mix，Applied Biosystems公司）进行定量。考虑到miRNA在血清中的丰度不高，用TaqMan PreAmp MasterMix（Applied Biosystems公司）进行预扩增，扩增条件：50℃2min，95℃10min，12个循环：95℃ 15 s，60℃1min。预扩增产物按1∶2．5稀释，每10μl miRNA反应体系中加入5μl稀释后的产物。以RNU6作为内参照，采用real－time PCR中的相对定量法进行分析，反应条件为：95℃5min，95℃15 s，60℃1min，40个循环。实验所用引物及探针均由Applied Biosystems公司合成。引物序列分别为：miR－200a：5＇－CTGTGAGCATCTTACCGGA－3＇；miR－200b：5＇－TGGATGGAGTCAGGTCTCTA－3＇；miR－200c：5＇－CAGTGAGGCTGGGATTCG－3＇；miR－100：5＇－CGTAGATCCGAACTTGTGGTAT－3＇。

1.3 统计学处理采用SPSS17．0统计软件对数据进行统计学分析。用Mann－Whitney U检验方法分析卵巢癌患者和健康人血清miR－200a、miR－200b、miR－200c及miR－100表达差异，采用one－way ANOVA分析不同病理类型卵巢癌患者血清miR－200a、miR－200b和miR－200c表达差异，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA在卵巢肿瘤患者及正常对照者血清中的表达水平比较miR－200a、miR－200b、miR－200c在卵巢癌患者的表达水平较正常对照组显著上升，且差异均有统计学意义（P均＜0．001），而miR－100在卵巢癌患者的表达水平较正常对照组显著下降，且差异有统计学意义（P<0．001）（图1）。另外，miR－200a、miR－200b、miR－200c和miR－100在良性肿瘤患者和正常对照组间的表达差异均无统计学意义（P均>0．05）。

表1 卵巢肿瘤病理诊断结果

图1 miRNA在和卵巢癌患者和正常对照组血清中的表达差异

2.2 miRNA的表达与卵巢癌病理类型的关系miR－200a、miR－200b和miR－200c在透明细胞癌的表达水平明显高于浆液性和黏液性癌，且差异均有统计学意义（P均＜0．05）。miR－200b在浆液性癌中的表达水平高于黏液性癌，miR－200c在透明细胞癌中的表达水平高于子宫内膜癌，且差异均有统计学意义（P均＜0．05）。（图2）。

图2 miRNA表达与卵巢癌临床病理类型的关联

3 讨论

现在临床上主要通过查体、B超和血清癌糖蛋白抗原CA－125检测来筛查卵巢癌。但是，CA－125只在不到50%的早期患者中能检测到，而且在妊娠、月经期、子宫内膜炎，以及其他非卵巢肿瘤中也可检测到其水平的升高［3］，因此，临床迫切需要寻找到新的肿瘤标志物用于卵巢癌的早期诊断、治疗和预后评估。

miRNA是一类非编码小分子RNA，通常为17～22个核苷酸长度。主要参与细胞的增殖与凋亡、个体发育的调控及肿瘤的形成等生物学过程，与肿瘤的发生和发展有着非常密切的关系［4］。Lu等［5］利用miRNA液态芯片研究了20种不同肿瘤的miRNA表达谱，发现每一种肿瘤都有一个相对稳定、特征性的miRNA表达谱。根据miRNA表达水平的差异可准确确定大多数低分化肿瘤的器官或组织起源［6］。总体而言，miRNA基因表达、调控的异常主要涉及有或无的差别，以及表达丰度高或低的差异。肿瘤特异性的miRNA表达谱的发掘对于肿瘤诊断、分型、寻找低分化肿瘤的原发灶具有重要临床价值，对于肿瘤的个体化治疗也具有重要的指导意义。

miRNA的表达具有组织特异性，同样可以在血液中检测到，并且与肿瘤的临床行为相关［7，8］。这类小分子在肿瘤中有着不同的表达谱，可以用来区分正常组织和癌组织，并且可以区分卵巢癌的不同亚型［9］。Chen等［10］对血液样本进行不同极端条件处理，包括极端pH（pH＝1、pH＝13）处理3 h，反复冻融，以及延长储存期等，血清miRNA依然稳定。这些特点使得血清miRNA非常适合作为一种分子标志物用于肿瘤的诊断、治疗及预后监测。但miRNA对RNA酶降解抵抗的机制目前尚不清楚，有待进一步研究。另外，miRNA在外周血中具体以怎样的形式存在、循环，目前尚无统一意见，可能是以脂蛋白、凋亡小体等形式存在。针对其来源，有学者认为是肿瘤细胞释放其内源性miRNA进入外周血循环，且血清中的miRNA分子能保持良好的稳定性［10，11］；或者是组织细胞特异性表达的miRNA因细胞坏死而直接进入血循环，导致特定疾病状态下特定循环miRNA的表达水平显著变化［12，13］。

本文研究检测了4个miRNA（miR－200a、miR－200b、miR－200c、miR－100）在卵巢癌患者和正常对照者血清中的表达水平，结果显示，这4个miRNA表达水平在两组人群中差异均有统计学意义（P均< 0．001）。而在良性卵巢肿瘤组与正常对照组比较差异均无统计学意义（P均＞0．05）。提示，上述4个miRNA可以作为卵巢癌的肿瘤标志物用于其临床诊断。另外，miR－200a、miR－200b和miR－200c在卵巢癌的不同病理类型中的表达差异有统计学意义，提示其表达水平的检测可用于卵巢癌病理类型的诊断并对指导临床治疗有重要的价值。

Mateescu等［14］报道，miR－200a以P38a为调节靶点，调节氧化应激反应，高度恶性的卵巢癌表达高水平的miR－200a和低浓度的P38a，且高表达miR－200a的卵巢癌患者对治疗的反应性好，预后好。Park等［15］报道miR－200c高表达的患者其生存率反而更好，推测其机制可能是由于miR－200c的靶蛋白ZEB1所致，此蛋白是关键的转录调控子，调节上皮细胞间充质化，使细胞保持在一种低侵袭性的上皮细胞状态中。而化疗敏感性则可能是由miR－200c的另一个靶蛋白TUBB3／Ш型β－微蛋白的下调所致，该蛋白可与紫杉醇结合，也或许是miR－200a驱动的氧化应激反应增加了对紫杉醇诱导产生的活性氧的敏感性［16］。不管是何种机制导致了肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性增加，miR－200家族的表达水平显然可以给临床医生的用药提供指导。

相对于正常对照者而言，miR－100在卵巢癌患者血清中的表达水平明显降低。笔者推测可能是由于miR－100本身能抑制肿瘤的进展，起到了类似于抑癌基因的作用，所以在肿瘤中是低表达的。但是Huang等［17］报道在胰腺癌中，转移性癌细胞里miR－100是高表达的，似乎miR－100可以促进胰腺癌细胞的转移，属于癌基因。Leite等［18］发现miR－100可以调控蛋白基因BAZ2A（溴结构区邻近至锌指结构区蛋白2A）、mTOR（雷帕霉素靶蛋白）、成纤维细胞生长因子受体3、自然凋亡相关蛋白2和肌动蛋白依赖性染色质调控因子5，但其究竟是发挥癌基因还是抑癌基因的作用，取决于其所处的分子环境，单纯的升高或降低并不能直接预测患者的预后。相对于miR－200家族来说，miR－100可能并不能算一个独立预测因子。

miR－200家族的高表达不仅提示有卵巢癌的可能性，更可以用于患者对化疗反应和预后的评估，而miR－100表达的高低的临床意义则要取决于具体的分子环境，在卵巢癌中，其低表达可能促进了肿瘤的进展。至于发现更多有独立预测作用的miRNA，不但需要更多的样本进行筛查，更需要加强对其作用机制的研究，用以指导筛查方向。

1 Zhang L，HuangJ，YangN，etal．microRNAs exhibit high frequency genomic alterations in human cancer. Proc Natl Acad Sci USA，，2006，103：9136－9141．

2 GiannakakisA，CoukosG，HatzigeorgiouA，etal．miRNA genetic alterations in human cancers. Expert Opin Biol Ther，2007，7：1375－1386．

3 Dodge JE，CovensAL，LacchettiC，etal．Preoperative identificationof a suspicious adnexal mass：A systematic review and meta－analysis.GynecolOncol，2012，126：157-166．

4 Slack FJ，WeidhaasJB．MicroRNAs as a potential magic bullet incancer. Future Oncol，2006，2：73－82．

5 Lu J，GetzG，MiskaEA，etal．MicroRNA expression profiles classifyhuman cancers．Natur，2005，435：834－838．

6 Rosenfeld N，AharonovR，MeiriE，etal．MicroRNAs accurately identifycancer tissue origin. Nat Biotechnol，2008，26：462－469．

7 Resnick KE，AlderH，HaganJP，etal．The detection of differentiallyexpressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients usinga novel real－time PCR platform. Gynecol Oncol，2009，112：55-59．

8 Yu SL，ChenHY，YangPC，etal．MicroRNA signature predicts survivaland relapse in lung cancer. Cancer Cell，2008，13：48-57．

9 Iorio MV，VisoneR，DiLevaG，etal．MicroRNA signatures in humanovarian cancer.CancerRes，2007，67：8699-8707．

10 Chen X，Ba Y，Ma L，etal．Characterization ofmicroRNAs in serum：a novel classof biomarkers for diagnosisof cancerand other diseases. CellRes，2008，18：997－1006．

11 Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，etal．Circulating microRNAs as stable blood－based markers for cancer detection.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：10513－10518．

12 Wang K，Zhang S，Marzolf B，etal．Circulating microRNAs，potential biomarkers for drug－induced liver injury.Proc Natl Acad SciUSA，2009，106：4402－4407．

13 Starkey Lewis PJ，Dear J，Platt V，et al．Circulating microRNAs as potential markers of human drug－induced liver injury.Hepatology，2011，54：1767－1776．

14 Mateescu B，Batista L，Cardon M，etal．miR－141 andmiR－200a act on ovarian tumor genesisby controlling oxidative stress response.Nat Med，2011，17：1627－1635．

15 Park SM，Gaur AB，Lengyel E，etal．ThemiR－200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E－cadherin repressors ZEB1 and ZEB2.GenesDev，2008，22：894-907．

16 Leskela S，Leandro－Garcia LJ，Mendiola M，et al．ThemiR－200 family controls beta－tubulin III expression and isassociated with paclitaxel－based treatment response and progression－free survival in ovarian cancerpatients.Endocr RelatCancer，2010，18：85-95．

17 Huang JS，Egger ME，Grizzle WE，et al．MicroRNA－100 regulates IGF1－receptor expression in metastatic pancreatic cancer cells. Biotech Histochem，2013，88：397－402．

18 Leite KR，Morais DR，Reis ST，etal．MicroRNA 100：a context dependent miRNA in prostate cancer．Clinics（Sao Paulo），2013，68：797－802．

Clinical value of serum miR－200 fam ily and miR－100 detection in ovarian cancer diagnosis

QIU Zhen－hua，WANGMao－sheng，YANGChang－fu，et al．Departmentof Clinical Laboratory，the People＇s HospitalofGaozhou，Gaozhou 525200，China

ObjectiveTo study the clinical value ofmicroRNA in the diagnosis of ovarian cancer．Methods149 ovarian tumor patients and 30 healthy people were collected．The expression of serum miR－200a，miR－200b，miR－200c andmiR－100were detected by qRT－PCR，and the resultswereanalyzed statistically．ResultsThe expression of serum miR－200a，miR－200b and miR－200c in ovarian cancer patients were all higher than that of in control group,the expression of the serum miR－100 in ovarian benign tumor patients was lower than that of in control group，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.001）.There were no statistical significance in the differences of miR－200a，miR－200b，miR－200c and miR－100 levels between ovarian benign tumor patients and control group（Pall＞0.05）.The expression levels of serum miR－200a，miR－200b and miR－200c in clear cell carcinoma patients were all higher than that of in both serous and mucinous patients，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.The expression level of miR－200b in serous carcinomas patients was higher than that of in mucinous patients，and the expression level of miR－200c in clear cell carcinoma patients was higher than that of in endometrioid carcinomas,and the differences all had statistical significance（Pall＜0,05）.ConclusionThe expression of serum miR－200 family can be used for early diagnosis and evaluation of the curative effect and recurrent clinical value in ovarian cancer．

miR－200 family；miR－100；qRT－PCR；Ovarian cancer

10．3969／j．issn．1674－7151．2014．01．002

2014－02－09）

（本文编辑：陈淑莲）

广东省科技计划（2012B031800344）；广东省医学科研基金（A2011671）

525200 高州市，广东省高州市人民医院检验科（邱振华 王茂生 杨长福）

525000 茂名市，广东省茂名市人民医院检验科（魏凯 杨越红 麦大海）

邱振华，E－mail:qiu3122＠sina.com