《植物组织培养脱毒苗病毒的PCR检测》实验课课程开设研究

陈裕坤，林玉玲，刘生财，张梓浩，赖钟雄

（福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建农林大学园艺学院园艺生物技术实验室，福建福州 350002）

《植物组织培养脱毒苗病毒的PCR检测》实验课课程开设研究

陈裕坤，林玉玲，刘生财，张梓浩，赖钟雄*

（福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建农林大学园艺学院园艺生物技术实验室，福建福州 350002）

植物组织培养是现代生物技术的重要组成部分，随着PCR检测技术在生产上的广泛应用，PCR法检测脱毒苗病毒实验课程的建立显得尤其重要。以香蕉试管苗束顶病病毒的PCR检测为例建立了新的实验课程，在实验内容设计、实验方法优化、实验课程安排及实验考核等方面进行了研究和探索。经过3年的有益实践表明，该课程取得了较好的教学效果，提高了大学生的科研能力和植物组织培养应用技能。

植物组织培养；脱毒苗；病毒；PCR检测；实验课程

植物组织培养是一门应用性、实践性强的专业课程，实验课的重要性尤为突出，其在要求学生掌握基本实验技能的同时，还要求学生自行设计实验解决生产中面临的实际问题[1-4]。福建农林大学园艺学院园艺植物生物工程研究所在1992年就已开设了《园艺植物组织培养》实验教学课程[5]，这门实验课程的主要内容为工厂化生产车间的设计、培养基配制、外植体消毒与接种、继代增殖等。随着生物技术的不断发展，PCR检测技术成为香蕉[6-7]、非洲菊[8]、甜樱桃[9]、瓯柑[10]、马铃薯[11-12]、草莓[13]等植物组织培养脱毒苗病毒检测的最重要手段之一。但目前的组织培养实验教材几乎没有涉及这方面的内容，因此，该实验室在前人的基础上依据实验课程开设的要求，结合实验样品取材与本科教学实验课的科学性、可执行性等因素，以香蕉试管苗的束顶病病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）的PCR检测为例，新开设了《植物组织培养脱毒苗病毒的PCR检测》这门实验课程，在实验课程建立、实验内容设计、实验方法优化、实验课程安排和实验考核等方面进行研究和探索，以提高大学生的科研能力和组织培养应用技能。

1 实验课程建立——以香蕉试管苗束顶病病毒的PCR检测为例

1.1 目的要求

通过实验课程掌握园艺植物试管苗病毒的PCR检测方法，能自行设计试验解决生产上面临的实际问题。

1.2 仪器设备与试剂

1.2.1 仪器设备。PCR扩增仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、超微量紫外可见分光光度计、台式离心机、微波炉、移液器、纯水系统、制冰机、冰箱、高压锅、离心管、PCR管等。

1.2.2 试剂。植物总DNA提取相关试剂、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、rTaq酶、10×PCR Buffer、DNA Marker、dNTP Mix、Loading Buffer等。

1.3 实验材料

以香蕉试管苗为检测材料，以经酶联免疫吸附法检测带束顶病的香蕉试管苗为阳性对照材料，以无病毒香蕉试管苗为阴性对照材料。

1.4 实验方法

1.4.1 香蕉基因组DNA的提取。采用改良CTAB法[14]提取香蕉叶片的基因组DNA（图1）。再经琼脂糖凝胶电泳、超微量紫外可见分光光度计法检测提取的DNA质量、纯度和浓度，选取A260/A280为1.8～2.0的总DNA，稀释至20 ng/μL，于-20℃冰箱保存备用。

图1 香蕉基因组DNA提取

1.4.2 引物设计与合成。根据GenBank数据库中已报道的多个BBTV株系的复制酶基因的高度保守序列处设计1对上下游引物，用于香蕉束顶病毒复制酶基因的扩增。引物序列为BBTV-F：5′-ATGGCGCGATATGTGGTATG-3′；BBTV-R：5′-TCAGCAAGCAACTAGCTTTATTC-3′。扩增产物大小预计为860 bp左右。引物由华大基因公司合成，用ddH2O溶解至终浓度为10 μmol/L后，置于-20℃冰箱中保存备用。

1.4.3 PCR检测体系。PCR检测体系总体积为25 μL：香蕉DNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2 μL，rTaq（5 U/μL）0.2 μL，补ddH2O至总体积为25 μL。

1.4.4 PCR扩增程序。PCR扩增程序设置：94℃预变性3 min，（94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s）总共35个循环，最后再72℃终延伸10 min。调整好反应程序，将上述混合物稍加离心后进行PCR扩增。

1.4.5 电泳分析。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳20 min（电压180 V，电流180 mA）后，于凝胶成像系统中拍摄电泳结果图，并对PCR检测的结果进行相应分析。如图2所示，3、4、6、10的试管苗与阳性对照1的检测结果相一致，均检测出860 bp左右的目的片段，初步判断其可能感染了束顶病病毒；而5、7、8、9的试管苗与阴性对照2的检测结果相同，未检测出目的片段，说明其可能不带束顶病病毒，试管苗脱毒成功。

图2 香蕉束顶病病毒电泳检测结果

1.4.6 PCR产物的序列分析及验证。将与阳性对照相一致的PCR扩增产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后连接到PMD-18T载体上，并将连接产物转化到DH5a感受态细胞中，经PCR检测为阳性的克隆子送深圳华大基因公司测序。序列测定结果表明，BBTV扩增片段为861 bp（图3），符合预期产物大小，是BBTV DNA的部分序列。与GenBank中香蕉其他众多BBTV株系的复制酶基因分离物的相似性在96%～98%，表明该实验方法能快速准确的检测出香蕉试管苗是否携带束顶病病毒，可将该方法应用于本科实验教学中。

图3 香蕉束顶病病毒（BBTV）扩增片段测序结果

2 实验课程安排与考核

2.1 准备工作

无毒香蕉试管苗和感染束顶病病毒的香蕉试管苗由实验室培养、保存；仪器设备、PCR相关试剂，高压灭菌的枪头、离心管与PCR管等耗材由老师课前备好待用；植物总DNA提取缓冲液等配制由老师课前配制好备用。

2.2 课程安排

目前，该实验课程主要面向福建农林大学的园艺、园林等专业授课，每年的学生人数近200人，因此实验课程的安排以小班的形式进行，每班30人左右分6个小组，即每个小组5人。课程学时为3学时，课程内容包括上述的DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测以及撰写实验报告。其中DNA提取2 h，PCR扩增2 h，琼脂糖凝胶电泳检测约20 min，实验报告撰写由学生课后完成。

2.3 考核

传统的《园艺植物组织培养》实验课程考核主要采取“考勤+实验报告”的方式，无法客观的体现教学效果。因此，需要对传统的考核机制进行改革，该实验课程从DNA提取、PCR扩增体系建立、PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳等过程对学生的操作技能有较高的要求，因此考核以出勤、任务完成、实验操作和实验报告撰写为依据设计考核办法。考核成绩由出勤、任务完成、实验操作和实验报告组成，比例为1∶2∶3∶4。同时该实验室向校教务处申请该课程的教学改革，增加实验成绩在《园艺植物组织培养》课程中的比重，由原来的20%提高到30%，使学生充分认识到实验教学的重要性，进而增加学习的自主性，提高实验教学的效果。

3 小结

植物组织培养技术在离体快繁、脱毒、遗传改良、离体保存、次生代谢物生产、人工种子生产、试管花卉应用以及植物学相关的教学和科研领域等发挥了重要作用。该实验室在前人的基础上，根据目前工厂化育苗生产上的需要，开设了《园艺植物组织培养脱毒苗病毒的PCR检测》实验课程，经过3年的实践，证明该实验开设很有必要，并且学生学习效果和热情都很高。通过在实验教学环节的不断优化和改进，取得了良好的教学效果，提高了大学生的组织培养实验技能和组织培养应用技能。同时使大学生具备一定的科研能力，在解决生产面临实际问题的时候能自行设计试验解决问题，增强其社会竞争力，为许多教学科研单位、生物工程公司及组织培养相关农业企业输送了大量熟练应用植物组织培养技术的人才。

[1]张红.植物组织培养实验教学研究[J].安徽农学通报，2009，15（15）：219，224.

[2]贾晋，陈敏洁，王晶妍，等.植物组织培养实验课程的教学研究与实践[J].科技信息，2010（35）：26-27.

[3]杨鹭生，李国平.“植物组织培养”实验教学改革与实践[J].莆田学院学报，2003，10（3）：63-65.

[4]林玉玲，赖钟雄，刘生材，等.《园艺植物组织培养》课程改革探讨[J].园艺与种苗，2013（6）：36-38.

[5]陈振光，林顺权，王天池.农业院校开设植物组织培养课程的做法和体会[J].植物生理学通讯，1993，29（4）：292-293.

[6]饶雪琴，张曙光，高乔婉.工厂化组培香蕉分化芽中病毒的检测[J].华南农业大学学报，2005，26（1）：64-66.

[7]饶雪琴.香蕉上两种病毒在香蕉分化芽中的PCR检测[J].植物保护学报，2007，34（4）：441-442.

[8]栾爱萍.非洲菊茎尖超低温脱毒及病毒检测技术[D].长沙：湖南农业大学，2012.

[9]代红艳，张志宏，吴禄平，等.甜樱桃茎尖培养及PNRSV的RTPCR检测[J].园艺学报，2003，30（1）：87-89.

[10]姜玲，陈泽雄，徐象华，等.瓯柑微芽嫁接脱毒及试管苗的快速培育技术[J].华中农业大学学报，2007，26（2）：233-236.

[11]孙琦，张春庆.PVY～N与PVY～O病毒RT-PCR快速检测体系研究[J].中国农业科学，2005，38（1）：213-216.

[12]贾霁，肖启明，刘剑峰，等.马铃薯Y病毒病的检测技术及防治策略[J].园艺与种苗，2013（1）：1-5，47.

[13]陈晓军，王敬东，马洪爱，等.利用RT-PCR对脱毒草莓苗病毒检测研究[J].北方园艺，2010（23）：146-148.

[14]GAWEL N J，JARRET R L.A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomea[J].Plant Mol.Biol.Report，1991，9（3）：262-266.

（责任编辑 金苹）

Establishment of the Experimental Course “Detecting Virus of Virus-free Seedlings from Plant Tissue Culture by PCR Assay”

CHEN Yu-kunet al.(Institute of Horticultural Biotechnology,Teaching Lab of Horticultural Biotechnology of Horticulture College,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002)

Plant tissue culture is an important part of modern biotechnology,and with the wide applications of PCR detection technology to the production,to establish an experimental course of detecting the virus of virusfree seedlings by PCR assay is especially important.This article took the PCR detection of banana tube seedling banana bunchy top virus(BBTV)as an example to establish a new experimental course,which studied and explored the design of the experimental content,optimization of the experiment method,arrangement of the experimental curriculum and the examination of the experiment course,etc.It has been proved to be beneficial to improvement of the experimental teaching effects and the university students'abilities of research and application skills for plant tissue culture by threeyears practice.

Plant tissue culture;Virus-free seedling;Virus;PCR detection assay;Experimental course

Q813.1+2，C41

A

2095-0896（2014）10-032-03

福建农林大学园艺特色专业建设点项目（111zt0903）；福建农林大学本科教学改革立项项目（111409017）；福建农林大学本科考试改革试点课程（农林大教字[2011]65号）；福建农林大学本科教学改革项目（111412099）。

陈裕坤（1984-），男，福建龙岩人，助理实验师，博士研究生，从事园艺植物生物技术研究。*通讯作者，研究员，博士，博士生导师，从事植物生物技术研究。

2014-08-11