乙型脑炎病毒NS1'蛋白编码框的扩展对病毒毒力的影响

郭亦非，郑 浩，郑旭晨，童 武，刘 飞，梁 超，单同领，于 海，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

乙型脑炎病毒NS1'蛋白编码框的扩展对病毒毒力的影响

郭亦非，郑 浩，郑旭晨，童 武，刘 飞，梁 超，单同领，于 海，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

通过分析乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）基因组中核糖体移码序列，在对NS2A基因实施同义突变基础上，设计2组引物，通过PCR突变方法，依次删除移码后NS1'基因开放阅读框的终止密码子，并将突变片段替换JEV感染性克隆pJEHEN中相应片段，获得了2株突变全长克隆。经体外转录合成RNA，再以RNA转染细胞，拯救出两株突变病毒vJET1和vJET2。通过RT-PCR扩增突变病毒中含突变位点的基因组片段，测序证实了vJET1基因组3690位核苷酸存在由T向A的突变，vJET2基因组3690位和3819位核苷酸均存在由T向A的突变。将vJET1和vJET2感染Vero细胞后，Western blot检测显示，两株突变病毒表达的NS1'蛋白均出现延长现象。生长曲线显示，与亲本病毒vTHen相比，突变病毒增殖速度均出现下降。动物实验显示，与vTHen相比，vJET1和vJET2对小鼠的神经毒力与神经侵袭力也出现下降。上述结果表明，NS1'编码框的延伸降低病毒在体外培养细胞上的增值速度，也减弱了病毒对小鼠的毒力。

乙型脑炎病毒；NS1'；突变；毒力

乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种黄病毒科黄病毒属乙型脑炎血清群病毒，同血清群还包括其他脑炎病毒如：西尼罗河病毒（West Niles virus，WNV）、墨累谷脑炎病毒（Murray Valley encephalitis virus，MVEV）和圣路易斯脑炎病毒（St. Louis encephalitis virus，SLEV）[1]。乙型脑炎病毒主要由库蚊传播，人（尤其是儿童）能感染该病毒并出现较严重的症状及后遗症。JEV是单股正链RNA病毒，只含有一个开放阅读框，长度大约为11 kb，依次编码C蛋白、prM蛋白、E蛋白、NS1蛋白、NS2A蛋白、NS2B蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白和NS5蛋白[2]。试验中发现，JEV感染哺乳动物细胞中存在一NS1相关蛋白，分子量较NS1相比约大8 kDa，称为NS1'蛋白[3,4]。目前研究发现，NS2A基因存在七联核苷酸滑动序列（CCCUUUU）和序列后的二级茎环结构，NS1'蛋白是NS2A基因在病毒复制过程中发生-1核糖体移码的表达产物，移码后所表达的NS1'蛋白与NS1蛋白相比在C端有52个氨基酸的延伸[5]。

本研究通过对NS2A滑动序列后片段进行同义密码子突变操作，改变NS1'蛋白C末端氨基酸序列，从而分析NS1'蛋白分子量变化表达对JEV病毒生长特性与毒力的影响。

1 材料与方法

1.1 病毒及细胞JEV Hen0701株感染性克隆pHJEV及其拯救病毒vTHen毒株[6]、BHK-21细胞与Vero细胞均由本实验室制备保存；BHK-21细胞与Vero细胞分别使用含10%胎牛血清的MEM培养基和DMEM培养基培养。

1.2 主要实验材料及实验动物抗JEV 6E蛋白单克隆抗体3E6由本实验室制备；抗JEV NS1蛋白单克隆抗体1H6由中国农科院哈尔滨兽医研究所华荣虹博士惠赠；MEM培养基购自Sigma公司；DMEM培养基与胎牛血清购自GIBCO公司；3周龄KM雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.3 突变病毒的构建根据对Hen0701株基因组核糖体移码序列末端的分析，在NS2A基因同义突变的基础上，通过PCR定点突变方法（引物见表1），以HEN0701株基因组第二片段克隆pHENC2为模板，以PJET1F和PJET1R为引物，进行定点PCR突变。50 μL PCR产物加入2 μLDpnI，37℃作用2 h, 取7 μL转化感受态细胞，获得的突变克隆质粒进行序列分析鉴定，称之为pHENC2T1。按上述方法，以pHENC2T1为模板，以PJET2F和PJET2R为引物，进行定点PCR突变，获得突变分子克隆pHENC2T2。以AgeI和XmaI分别酶切pHENC2T1、pHENC2T2和pJEHEN，胶回目的片段并进行连接，获得了突变全长分子克隆pJEHENT1和pJEHENT2。

1.4 突变病毒的拯救以MluI酶切pJEHENT1和pJEHENT2进行线性化，并以核酸回收试剂盒QIAquick PCR Purifcation kit回收。按mMessage mMachine T7 Kit说明书，进行体外转录。取2 μL转录RNA进行电泳，其余冻存于－80℃。

6孔板中的BHK-21细胞，生长至密度达75%～85%，以DMRIE-C将转录RNA 1 μg转染细胞。转染后6 h换液，每天观察细胞。细胞病变达60%至80%收获上清，并接种BHK-21细胞，收获的病毒液所获得突变病毒分别命名为vJET1株、vJET2株。

表1 构建突变病毒感染性克隆引物Table 1 Primers for constructions of mutant JEV clones

1.5突变病毒的鉴定 将拯救的突变病毒vJET1株、vJET2株和vTHen株分别感染单层BHK-21细胞，以JEV E蛋白单克隆抗体3E6为一抗进行间接免疫荧光检测。

以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取vJET1株和vJET2的基因组，以引物pJEF3322、pJER3927扩增片段测序突变位点。

1.6 NS1蛋白与NS1'蛋白的表达鉴定将vJET1株、vJET2株与vTHen株以0.1 MOI的剂量分别感染单层Vero细胞，感染后提取细胞总蛋白，使用抗JEV NS1蛋白单抗1H6为一抗，作Western blot检测。

1.7 突变病毒的一步生长曲线与多步生长曲线测定将vTHen株、vJET1株与vJET2株以5 MOI的剂量和0.01 MOI的剂量分别感染BHK-21细胞，固定时间分别收取200 μL细胞上清至－80℃保存后，按Reed-Muench法进行各时间点的病毒TCID50测定计算。以感染后收毒时间为横坐标，病毒TCID50/mL的对数为纵坐标，分别绘制一步生长曲线与多步生长曲线，以此比较vTHen株与vJET1株、vJET2株在BHK-21细胞上的生长特性差异。

1.8 神经毒力与神经侵袭力试验将3周龄昆明雌性小鼠随机分组，每组7只，进行神经毒力试验。以DMEM稀释各突变病毒与对照毒株vTHen，各病毒分别稀释为7组，每组每只接毒量为5×10-2～5×104TCID50（10×倍比稀释）；空白对照组每只脑内接种0.05 mL DMEM。观察记录每组死亡状况至接毒后17 d。

将3周龄昆明雌性小鼠随机分组，每组5只，进行神经侵袭力试验。以DMEM稀释各突变病毒与对照毒株vTHen，各病毒分别稀释为6组，每组每只接毒量为10-1～104TCID50（10倍倍比稀释）；空白对照组每只皮下接种0.1 mL DMEM。观察记录每组死亡状况至接毒后17 d。

2 结果

2.1 突变病毒的鉴定将突变全长克隆pJEHENT1和pJEHENT2体外转录的RNA感染BHK-21细胞后，于72 h后出现细胞病变。收取该细胞上清继续感染BHK-21细胞，感染后48 h出现细胞病变。

将vJET1株、vJET2株与vTHen株分别感染BHK-21细胞后，使用抗JEV E蛋白单克隆抗体3E6进行间接免疫荧光检测。结果发现，vJET1株、vJET2株与vTHen株感染后的细胞能与该单抗发生特异性反应，观察到特异性荧光，而同时空白对照组细胞与该抗体不能发生特异性反应（图1）。这表明，RNA转染获得了感染性病毒。

提取拯救病毒vJET1株、vJET2株基因组RNA，反转录后扩增含突变位点的片段后进行测序，结果显示，突变基因均处于预期位置，vJET1基因组3690位由T突变为A，vJET2基因组3690位和3819均由T突变为A（图2）。

图1 vTHen株、vJET1株和vJET2株病毒感染BHK 21细胞后免疫荧光鉴定Fig. 1 Indirect immunofluorescence assay(IFA) detection of BHK 21 cells infected by vTHen, vJET1 or vJET2

2.2 NS1蛋白与NS1'蛋白的表达鉴定将vJET1株、vJET2株与vTHen株感染Vero细胞，感染后24 h提取细胞总蛋白。Western blot检测结果显示，vTHen株感染细胞后所提取总蛋白中能在约48 kDa和56 kDa处检测到正常NS1蛋白与NS1'蛋白的表达，而vJET1株和vJET2感染细胞后所提取总蛋白中除能在检测到NS1蛋白的表达外，vJET1株和vJET2株分别能在约70 kDa和约100 kDa处检测到分子量增大的NS1'蛋白，见图3。

图 2 vJET1、vJET2和Hen0701突变位点测序序列比较Fig. 2 Comparison of mutant regions sequencing of vJET1, vJET2 and Hen0701

图 3 Western blot鉴定vTHen株、vJET1株和vJET2株病毒感染Vero细胞后NS1蛋白与NS1'蛋白表达情况Fig.3 Western blot detection of NS1 and NS1' in lysates of Vero cells after vTHen, vJET1 and vJET2 infections

图4 vTHen株、vJET1株和vJET2株在BHK 21细胞上生长曲线Fig. 4 The growth curve of vTHen, vJET1 and vJET2 in BHK 21 cells

2.3 vJET1株、vJET2株与vTHen株在BHK-21细胞上生长特性分析将vJET1株、vJET2株与vTHen株病毒以5 MOI的剂量和0.01 MOI的剂量分别感染BHK-21细胞，并绘制vJE2R株、vJET1株、vJET2株与vTHen株的一步生长曲线与多步生长曲线。一步生长曲线与多步生长曲线结果均显示， vJET1株、vJET2株的增殖能力明显低于vTHen株，而vJET1株与vJET2株之间增殖能力则基本相近，见图4。

2.4 突变病毒神经毒力与神经侵袭力试验将vJET1、vJET2和vTHen分别通过颅内和皮下方式接种小鼠，比较3株病毒对小鼠的神经毒力和神经侵袭力。神经毒力试验结果显示，以5×104TCID50脑内接种vJET1株与vJET2株的小鼠，死亡率分别为42.9%与14.3%，以5×103TCID50颅内接种JET1株和vJET2株病毒的小鼠就已不出现死亡（图5）。而以5×103TCID50剂量接种vTHen株的小鼠死亡率仍为100%。神经侵袭力试验中，vJET1株与vJET2株在任意剂量均未出现死亡，而vTHen株在1×104TCID50皮下接种时死亡率为60%（图5）。Log-rank检验各毒株相同剂量攻毒小鼠存活曲线，结果均为极显著，这表明，与vTHen相比，vJET1和vJET2对小鼠的毒力出现下降。

3 讨论

JEV NS2A编码区核糖体移码区域能形成特殊的RNA二级结构[5]，本研究通过分析该区域的核酸序列，进行密码子同义突变操作，人为改变NS1'蛋白终止密码子的位置，将移码后阅读框终止密码子后延，使得NS1'蛋白延长。通过vJET1引物突变消除原NS1'移码序列终止密码子，使得NS1'蛋白终止于下一处密码子，预计获得延长43个氨基酸的NS1'蛋白；在突变原有终止密码基础上，使用vJET2引物突变消除第二处密码子，预计获得延长118个氨基酸的NS1'蛋白。结果显示，突变后病毒能够成功拯救，所获得突变病毒vJET1株、vJET2株分别能检测到预期的大小改变的NS1'蛋白的表达。这表明，NS1'蛋白大小的改变并不影响病毒的拯救。

图5 vThen株、vJET1株和vJET2株攻毒后小鼠存活曲线Fig. 5 Survival of mice challenged with vThen, vJET1 or vJET2

NS1蛋白是一种具有多种功能的糖蛋白，在病毒复制过程中起重要作用[7]。目前发现，NS1'蛋白在病毒复制中可以替代NS1蛋白的功能[8]，但NS1'蛋白的功能还没有得到全面了解。在对JEV同血清群病毒WNV的Kunjin株的研究中发现，NS1'蛋白的表达缺失可能会影响病毒的神经毒力[9]。本试验中，所构建突变病毒vJET1株、vJET2株感染细胞后均能检测到分子量增大的NS1'蛋白表达，通过对突变病毒在BHK-21细胞上生长特性分析发现，改变移码序列终止密码位置后，突变病毒在BHK-21细胞上复制能力较vTHen毒株相比有明显的下降。突变毒株增殖能力下降的同时，其毒力也较对照毒株有极为明显减弱。通过这些结果分析，延长的NS1'蛋白的表达能够影响JEV病毒的毒力与生长特性，降低了病毒在细胞上的复制能力，以及病毒的神经毒力和神经侵袭力，然而延长的NS1'蛋白造成以上影响的机制还有待探讨。同时，NS1'蛋白不同的表达状态如何具体影响病毒的复制与毒力还有待进一步的研究。

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ELONGATITON OF NS1' PROTEIN REDUCES VIRULENCE OF JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS

GUO Yi-fei, ZHENG Hao, ZHENG Xu-chen, TONG Wu, LIU Fei, LIANG Chao, SHAN Tong-ling, YU Hai, TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 20041, China)

To study effect of elongated NS1' protein on virulence of Japanese encephalitis virus, two pairs of primers were designed to eliminate stop codons in NS1' gene without amino acid substitutions in NS2A protein. Two full-length mutant clones pJEHENT1 and pJEHENT2 were constructed from the infectious clone of JEV pJEHEN using site-directed mutation of PCR. Sequencing of the rescued viruses vJET1 and vJET2 revealed a T-A mutation at nt 3690 in vJET1 and the same T-A mutations at nt 3690 and nt 3819 in vJET2. Both vJET1 and vJET2 expressed extended NS1' proteins in Vero cells. The growth curves showed that the mutant viruses vJET1 and vJET2 propagated slower than their parent virus vTHEN. Additionally, reduction of neurovirulence and neuroinvasiveness of vJET1 and vJET2 was noted in mouse pathogenecity test. These results indicated that the elongated NS1' protein slowed down growth of the mutant viruses in Vero cells and decreased their virulence to mice.

Japanese encephalitis virus; NS1'; mutation; virulence

S852.659.6

A

1674-6422（2014）02-0027-05

2014-01-14

国家自然基金青年基金项目（31201917）；上海市自然基金项目（11ZR1446200）

郭亦非，男，硕士研究生，预防兽医学专业

童光志，E-mail∶gztong@shvri.ac.cn；郑浩，E-mail∶haozheng@shvri.ac.cn