伪狂犬病毒变异株（JS-2012）对仔猪的致病性研究

童 武，郑 浩，单同领，刘 飞，梁 超，李国新，姜一峰，于 海，高 飞，周艳君，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

伪狂犬病毒变异株（JS-2012）对仔猪的致病性研究

童 武，郑 浩，单同领，刘 飞，梁 超，李国新，姜一峰，于 海，高 飞，周艳君，童光志

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

本实验室2012年从江苏省太仓市某发病猪场分离到1株变异的伪狂犬病毒，命名为JS-2012。为了研究该分离株对仔猪的致病性，将12头15日龄的伪狂犬病毒阴性仔猪随机分为3组，其中2组（每组5头猪）分别通过肌肉注射和滴鼻接种JS-2012毒，第3组2头猪做空白对照。接种病毒的仔猪在攻毒后24 h体温均开始升高，4 d后开始死亡，死亡率为100%。临床观察发现，滴鼻组仔猪发病死亡明显快于肌肉注射组。对病死猪进行剖解，均可见大脑血管扩张并出血等典型的伪狂犬病病理变化。病理切片显示猪的脑蛛网膜下腔严重出血，其他各脏器也均有严重病理变化。结果表明该变异株JS-2012为伪狂犬强毒毒株。

伪狂犬病毒；JS-2012；仔猪；致病性

伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种烈性传染病[1]。伪狂犬病毒能感染多种宿主，但猪是该病毒的主要天然宿主、贮存者和传播者[1,2]。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率，及种猪不育。伪狂犬病最早发生于美国，我国20世纪40年代末在猫中首次发现了伪狂犬病毒，60年代初在猪群中也出现该病毒流行，至今伪狂犬病毒仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪群的健康[3]，并造成了严重经济损失[4]。

我国猪场自20世纪末开始使用伪狂犬基因缺失疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。童武等[5]、彭金美等[6]分别从发病猪场分离到了伪狂犬病毒，并证实了流行毒较经典毒发生了较大变异。然而，这种变异的伪狂犬病毒对哺乳仔猪的致病性还不十分清楚，为此，我们开展了本项研究。

1 材料与方法

1.1 病毒、实验猪本研究所用的病毒（PRV JS-2012株，TCID50=10-6/0.1mL）由本实验室分离和保存。实验仔猪来源于浙江省绍兴市嵊州市某猪场，均为伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪瘟病毒（Classic swine fever virus，CSFV）和圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2）阴性，且通过IDEXX抗体试剂盒检测证实伪狂犬病毒gB、gE抗体也均为阴性。

1.2 试剂、细胞LATaqDNA聚合酶、dNTP mix、2×GC Buffer I、DNA Marker （DL 2000）等购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）和DMEM培养基为Invitrogen公司产品；Vero细胞由上海兽医研究所猪病实验室保存，以含10% FBS的DMEM培养基培养；gB、gE抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。

1.3 实验动物的分组、接种将15日龄的实验仔猪12头随机分成3组，第一组5头（编号：1、2、3、4、5）均通过颈部肌肉接种PRV JS-2012毒2 mL，分别含2×107TCID50（1、2）、1×106TCID50（3、4、5）。第二组5头（编号：6、7、8、9、10）通过滴鼻接种PRV JS-2012毒 2 mL，分别含2×107TCID50（6、7）、106TCID50（8、9、10）。第三组2头（编号：D1、D2）作空白对照。开始时2号和9号猪精神状态较其他猪弱，所用JS-2012株病毒均为第3代细胞培养毒，其滴度为：TCID50=10-6/0.1mL。

1.4 临床观察在攻毒前及攻毒后d1、d3、d5、d7、d9、d11、d13分别对每头仔猪进行采血（死亡的除外）。攻毒后每天观察2次，测量体温1次并记录临床症状。

1.5 病理观察对试验中发病死亡或试验结束迫杀的仔猪，进行病理剖检并观察病变。每头猪取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结等组织，用10% 中性福尔马林固定，委托上海西普尔必凯实验动物有限公司负责病理切片的制作。

1.6 病料检测对所采血样进行gB、gE抗体检测。所有仔猪的脑组织用gB、gE[5]的特异引物进行PCR检测。将处理好的病料接种Vero细胞，进行病毒分离。

2 结果

2.1 临床症状攻毒后d1，攻毒组所有仔猪体温均开始升高；d2，攻毒组所有仔猪体温均在40.5℃以上，且2号猪有明显的奇痒、走路摇晃等症状；d3，攻毒组仔猪均发烧至41℃以上，且2、9号猪有明显的神经症状；d 4上午9号猪死亡，2号猪濒死、四肢呈划水状，6、7、8、10号发病，均有共济失调等神经症状，且10号猪出现频繁用头撞墙动作；d 4下午，2、6、7号猪死亡；d 5，8、10号死亡，其他精神状态均不好；d 6，5号猪死亡，其他猪精神状态均较差；d 7，1号猪死亡，3号猪濒死，4号猪有间歇性神经症状及突然倒地抽搐；d 9，3号猪死亡，4号猪濒死；d 11，4号猪死亡。D1，D2猪从始至终均很健康，d 11强制杀死。根据测得实验猪体温数据，绘制攻毒后猪体温变化图（图1）。攻毒后，两种接种途径的猪体温均快速升高。而不同接种途径对试验猪死亡进程则有较大影响，滴鼻接种组比肌肉接种组死亡快，且整齐（图2）

2.2 剖解及PCR检测病死的实验仔猪大都体型消瘦且被毛粗乱。剖检见脑脊液明显增多，脑膜肿胀增厚、血管扩张，并伴随出血；肺脏轻度气肿，并伴有出血，坏死；腹股沟淋巴结明显充血肿胀；脾脏边缘明显淤血且肿大；肾脏可见点状出血；肝脏边缘淤血坏死。对照组各组织脏器均未见明显病理变化（图3），表明PRV JS-2012株的感染对猪的多个重要器官产生了侵害作用。攻毒组10头猪的脑样品，用PRVgB（633 bp）和gE（366 bp）的特异性引物分别扩增出了相应的基因片段（图4），接种Vero细胞后也均能产生典型的细胞病变，提示PRV JS-2012株侵入了所有感染猪的中枢神经系统。

图1 攻毒后猪的体温变化Fig.1 Body temperature changes of piglets post infection with PRV JS-2012

图2 攻毒后各组猪不同时间的存活情况Fig.2 Mortality of piglets post infection with PRV JS-2012

图3 攻毒组及空白对照组剖解后的眼观病变Fig.3 The autopsy lesions of piglets in infection group and control group

图4 攻毒组及空白对照组脑组织gB、gE基因的PCR扩增Fig.4 PCR-amplifi ed gB and gE gene from brains of infection group and control group

2.3 组织病理切片观察对攻毒组死亡或实验结束迫杀的对照组仔猪进行解剖。每头猪取脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结组织，用10% 中性福尔马林固定，进行病理切片制作。病理切片显示，攻毒组的猪脑蛛网膜下腔严重出血且脑水肿；淋巴结中的淋巴细胞显著减少；肝细胞有空泡性变性；肺脏有严重瘀血，出血；肾小管上皮细胞空泡性变性并出血；脾脏淋巴细胞显著减少。对照组各组织脏器均未见明显病理变化（图5）。

图5 攻毒组及空白对照组不同组织的病理切片观察（HE 200×）Fig.5 Pathological section observation of differet tissues in pigets of infection group and control group（HE 200×）

3 讨论

PRV感染仔猪，可呈现出不同临床症状。张桂云等[7]用PRV北京分离株接种7日龄健康仔猪，能引起仔猪死亡。但死亡猪的肾脏、肝脏、腹股沟淋巴结均未见明显眼观病理变化，且整个病程中猪的体温都没有升高。在本研究中，PRV JS-2012感染15日龄健康仔猪，24 h后体温都明显升高，且能引起接种猪急性死亡。剖解后可见脑严重出血，水肿；肺脏轻度气肿，并伴有出血，坏死；腹股沟淋巴结明显充血肿胀；脾脏边缘明显淤血且肿大；肾脏可见点状出血；肝脏边缘淤血坏死。病理切片也显示，攻毒组的猪脑蛛网膜下腔严重出血且脑水肿；淋巴结中的淋巴细胞显著减少；肝细胞有空泡性变性；肺有严重瘀血，出血；肾小管上皮细胞空泡性变性并出血；脾脏淋巴细胞显著减少。而对照组仔猪从始至终均很健康，剖杀后剖解各组织脏器均未见明显眼观病理变化，组织切片观察也未见明显病理变化。PRV毒力不同，感染仔猪后在体内的分布也不相同。谷长勤等[8]研究表明，PRV强毒感染后，病毒在全身均有分布，而弱毒株及中等毒力的毒株感染后病毒只分布于局部中枢神经等。JS-2012株接种猪后，能侵害多种主要器官，并造成肉眼可见的损伤，这显示JS-2012株是一株强毒株。

接种JS-2012株后24 h，两攻毒组仔猪的体温均开始升高，4 d后两组仔猪开始死亡，滴鼻组到d5全部死亡，肌肉注射组分别在d4，6、7、9、11时各死亡1头仔猪。虽然两攻毒组的死亡率均为100%，但滴鼻接种组的发病及死亡速度明显快于肌肉注射组。张斌等[9]、张桂云等[7]研究证实PRV不同毒株不同感染途径对仔猪的致病率是不同的，这与本研究结果相同。

滴鼻组6、7号猪接种病毒量是8、9、10号猪的20倍，攻毒后6、7号猪发病死亡速度较8、9（实验前状态略差）、10快。同样在肌肉注射组也呈现这一趋势。结果说明，不管何种接种途径，就接种剂量来看，接种剂量大的仔猪发病及死亡的速度也快。

本研究证实JS-2012毒株对哺乳仔猪的致病性非常强，致死率高达100%，且滴鼻接种的致死性要明显高于肌肉注射。这一结果为下一步研制基因缺失弱毒疫苗提供了数据支持，且为后续基因缺失弱毒疫苗的免疫评价实验提供了攻毒模型。

[1] 殷震,刘景华. 动物病毒学[M]. 2版. 北京: 科学出版社,1997: 700-713.

[2] 斯特劳 B E,阿莱尔 S D ,蒙加林 W L,等. 猪病学[M]. 8版. 北京: 中国农业大学出版社,2000: 195-196.

[3] 邓仕伟,汪勇,薛春芳. 我国伪狂犬病流行现状及新特点[J]. 动物医学进展,2006,27(9): 105-107.

[4] Tamba M,Calabrese R,Finelli E,et al. Risk factors for Aujeszky's-disease seropositivity of swine herds of a region of northern Italy[J]. Prev Vet Med,2002,54(3): 203-212.

[5] 童武,张青占,郑浩,等. 免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J]. 中国动物传染病学报,2013,21(3): 1-7.

[6] 彭金美,安同庆,赵鸿远,等. 猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析[J]. 中国预防兽医学报,2013,35(1): 1-4.

[7] 张桂云,甘孟侯,邓同炜,等. 仔猪人工感染伪狂犬病的病理学观察[J]. 中国兽医杂志,1997,23(7):16-17.

[8] 谷长勤,唐万勇,程国富,等. 仔猪人工感染伪狂犬病毒Ea 株的病理学观察[J]. 华中农业大学学报,2005,24(5): 489-491.

[9] 张斌,汪开毓,冯泽光,等. 仔猪伪狂犬病的病理学研究[J]. 畜牧兽医学报,1992,23(2):182-186.

PATHOGENICITY OF VARIANT STRAIN JS-2012 OF PSEUDORABIES VIRUS IN PIGLETS

TONG Wu,ZHENG Hao,SHAN Tong-ling,LIU Fei,LIANG Chao,LI Guo-xin,JIANG Yi-feng,YU Hai,GAO Fei,ZHOU Yan-jun,TONG Guang-zhi
(Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai 200241,China)

In December 2012,a variant strain JS-2012 of porcine Pseudorabies virus (PRV) was isolated from a diseased piglet in Taicang city Jiangsu Province. To study the pathogenicity of JS-2012,twelve 15-day-old PRV-free piglets were divided into 3 groups：intramuscular injection group (5 piglets),intranasal inoculation group (5 piglets) and non-treatment control group (2 piglets). At 24 h post infection,body temperature of piglets in ten 15-day-old inoculation piglets in two infection groups increased. At day 4 post infection,piglets in both infected group started to die. The intranasal group died faster than those in intramuscular injection group although the mortality of both infection groups was 100%. Dead piglets were necropsied for pathological examination. Vasodilatation and angiorhagia were found in brain,which were typical lesions caused by PRV. Severe subarachnoid hemorrhage and lesions in other organs were also recorded. In conclusion,JS-2012 was a virulent PRV variant.

Pseudorabies virus; JS-2012; piglets; pathogenicity

S852.659.1

A

1674-6422（2014）05-0010-05

2014-06-30

上海市自然科学基金项目（14ZR1448900)；中央科研院所公益性基础科研业务费项目（2014JB02）；国家生猪现代产业技术体系项目（CARS-36）

童武，男，硕士，实习研究员，主要从事猪伪狂犬病研究工作

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn