饱和氢气生理盐水对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的干预作用及可能机制

2014-04-13谢建平王赵伟吴承龙

浙江医学 2014年10期

谢建平王赵伟吴承龙

谢建平王赵伟吴承龙

目的探讨氢气对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的干预作用及可能机制。方法采用豚鼠脊髓匀浆和完全弗氏佐剂（CFA）混合的油包水乳剂诱导SD大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型；在EAE模型诱导后的第5～17天腹腔注射饱和氢气生理盐水（6ml/kg），对照组大鼠腹腔注射等量0．9%氯化钠溶液；观察并记录各组大鼠体重，行为学评分；在模型诱导后的第20天处死动物并作脑、脊髓HE染色，CD3免疫组化染色，光学显微镜下观察炎症情况，并用酶联免疫吸附法检测脊髓IL-17、INF-γ、IL-10表达，在模型诱导后第7、12、17天检测各组动物血清SOD水平。结果（1）H-EAE组大鼠诱导后体重下降度及神经行为缺损评分严重度均较EAE组轻；（2）H-EAE组大鼠中枢炎症细胞浸润较EAE组少；（3）H-EAE大鼠脊髓IL-17、INF-γ表达水平较EAE组低，但IL-10无明显差异；在EAE模型诱导后的第12天H-EAE大鼠血清SOD水平较EAE组高，在第7、17天则无明显差异。结论饱和氢气生理盐水可以减轻SD大鼠EAE的中枢炎症，可能与氢气在EAE炎症暴发过程中的抗氧化作用有关，即与提高SOD水平及抑制IL-17、INF-γ在炎症部位的释放有关。

氢气实验性自身免疫性脑脊髓炎 SOD IL-17 IL-10 INF-γ

多发性硬化（MS）是以炎症、脱髓鞘、神经胶质细胞增生为特点的最常见的中枢神经系统自身免疫性疾病[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型是MS常用动物模型，不仅具有相似的免疫学发病机制，在神经功能缺损的表现上也有非常相似的特点，因此EAE模型已经成为研究MS发病机制及研发新型药物的重要工具。2007年，Ohsawa等[2]报道，氢气（无色、无味、无臭气体）可以通过抗氧化应激作用而改善脑缺血再灌注损伤，并认为其机制可能是选择性清除羟自由基和过氧亚硝基阴离子。该研究引起了国际学界的广泛关注，之后的研究发现氢气在治疗缺血再灌注损伤的心脏、肝脏、肾脏及肺[3]等均有一定作用；而且在神经系统退行性疾病如帕金森病[4-5]也发现了其抗氧化作用，并有研究提示氢气尚有抗炎、抗凋亡及信号通路调节功能，这些可能共同介导了氢气的保护效应。在EAE发病过程的炎症爆发过程中不仅存在着免疫细胞活化参与的氧化应激，还释放大量的炎症介质损伤神经髓鞘，因此氢气的抗氧化应激作用可能对EAE也有保护作用。本实验通过腹腔注射饱和氢气生理盐水的方法，观察EAE发病大鼠行为学改变、组织学差异以及炎症介质、SOD的改变，旨在探讨氢气对EAE的干预作用及可能机制。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器饱和氢气生理盐水（上海第二军医大学潜水医学教研室），完全弗氏佐剂（CFA，美国Sigma公司），百日咳毒素与卡介苗（中国药品生物制品检定所），CD3抗体、SP免疫组化染色试剂盒及DAB显色剂（武汉博士德公司），SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所），IL-17、IL-10及INF-γ酶联免疫吸附法试剂盒（R&D公司），光学显微镜（Leica公司），图像分析软件IPP 5.1（Image Pro P1us 5.1），酶标仪（美国BIO-RAD），722可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 实验动物与分组豚鼠14只，180～200g；SD大鼠（清洁级）28只，8周龄，220～250g；均由上海斯莱克实验动物有限公司提供。将SD大鼠随机分为CFA组（8只）、EAE组（10例）、注射饱和氢气生理盐水的H-EAE组（10只）。

1.3 EAE模型制作及处理 EAE模型制作参考文献报道的方法[6]，主要步骤包括：豚鼠脊髓匀浆（GPSCH）和CFA等体积抽打成油包水乳剂，以该乳剂内注射于SD大鼠四肢足垫（0.4m1/只），在免疫当天及免疫后48h腹腔注射百日咳毒素疫苗1m1（1×109菌体）。CFA组则用0.9%氯化钠溶液代替豚鼠脊髓匀浆，再与CFA等体积混匀为乳剂后免疫SD大鼠。在EAE模型诱导后的第5～17天，H-EAE模型组腹腔注射饱和氢气生理盐水（6m1/kg），CFA组与EAE组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.4 行为学评分、动物处死和标本处理根据Kono等[7]规定的标准，定为0～5分：0分：无明显异常；1分：尾巴无力；2分：轻微后肢无力；3分：严重后肢麻痹；4分：四肢麻痹；5分：濒死或死亡。SD大鼠均在模型诱导后第20天用10%水合氯醛麻醉后，0.9%氯化钠溶液灌注左心室处死。取脑和脊髓在4%多聚甲醛中固定24h。常规脱水、透明、浸蜡制成蜡块，切片后用于HE染色和CD3免疫组织化学染色。部分脑脊髓组织立即冻存于液氮并转移到-70℃冰箱保存，用于检测炎症介质（IL-17、IL-10、INF-γ）。处死前尾静脉抽取的各血液标本经离心机离心（500g）获取的血清也冻存于-70℃冰箱，用于检测SOD。

1.5 组织学检测与评分 HE染色组织学评分参照Okuda等[8]提出的标准：0分：无炎症变化；1分：炎症细胞浸润仅限于血管周围和脊膜周围；2分：脊髓内轻微的炎症细胞浸润（1～10个细胞/片）；3分：脊髓内中度的炎症细胞浸润（11～100个细胞/片）；4分：脊髓内严重的炎症细胞浸润（＞100个细胞/片）。T细胞CD3免疫组化染色后镜检，以细胞质出现棕黄色为阳性细胞。每张片随机取3个高倍视野计数阳性细胞数，取其平均值作统计学处理。

1.6 血清SOD及炎症介质检测采用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD活性。采取尾静脉血1m1左右，用普通离心机500g离心获得血清，取50μ1血清用于SOD检测，具体检测方法参照说明书（南京建成生物工程研究所提供）。大脑、脊髓组织经室温解冻后立刻于细胞裂解液中匀浆，取上清夜用于ELISA检测（按照R&D公司试剂说明书操作）。

1.7 统计学处理采用SPSS16.0统计软件，计量资料以表示，神经行为学缺损评分及体重比较采用多因素方差分析，其余采用student-t检验。

2 结果

2.1 氢气对EAE大鼠体重的影响 3组大鼠EAE诱导后的日均体重情况见图1。

图1 3组大鼠EAE诱导后的日均体重情况

由图1可见，自诱导后的第13天开始，EAE组及H-EAE组大鼠体重开始下降，而CFA组大鼠体重一直增长；第14～20天H-EAE组较CFA组大鼠体重下降，第18～20天EAE组较H-EAE组大鼠体重下降，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

2.2 氢气对EAE大鼠行为学评分的影响 EAE组及H-EAE组诱导后行为学评分情况见图2。

由图2可见，第15～17天两组大鼠行为学评分的差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

2.3 组织学检测结果

2.3.1 HE染色结果 EAE组大鼠评分为1.23±0.12，H-EAE组为2.19±0.16，差异有统计学意义（P＜0.05）。3组大鼠HE染色光镜观察情况见图3。

2.3.2 CD3免疫组化染色结果 EAE组T细胞浸润数为1.16±0.18，H-EAE组为0.81±0.12，差异有统计学意义（P＜0.05）。3组大鼠CD3免疫组化染色光镜观察情况见图4。

2.4 氢气对EAE大鼠血清SOD的影响 CFA组大鼠血清SOD活性水平在模型诱导后的第7、12、17天无明显变化，而EAE组与H-EAE组SOD活性均呈现下降趋势。在第17天，EAE组SOD水平为（18.92±2.12）U/L，CAF组为（26.11±2.33）U/L，H-EAE组为（23.61±2.08）U/L，EAE组SOD水平明显低于CAF组及H-EAE组，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

2.5 氢气对EAE大鼠炎症介质表达的影响各组大鼠脊髓炎症介质表达的比较见表1。

表1 各组大鼠脊髓炎症介质表达的比较

由表1可见，与CFA组比较，EAE组及H-EAE组IL-17及INF-γ的表达水平均明显升高，EAE组IL-10表达水平明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.05）水平最高；与EAE组比较，H-EAE组IL-17及INF-γ的表达水平均明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

图2 EAE组及H-EAE组诱导后行为学评分情况

图3 3组大鼠HE染色光镜观察情况（a：CFA组；b：EAE组；c：H-EAE组；×400）

图4 3组大鼠CD3免疫组化染色光镜观察情况（a：CFA组；b：EAE组；c：H-EAE组；×400）

3 讨论

MS是一种以中枢神经系统白质脱髓鞘为特点的自身免疫性疾病。EAE是MS经典动物模型，其免疫学机制可以概括为[6]：髓鞘碱性蛋白被外周抗原递呈细胞吞摄取、加工、并将致病性抗原递呈给中枢淋巴细胞，幼稚淋巴细胞激活分化成各类致病性成熟免疫细胞，这些淋巴细胞破坏血脑屏障进入中枢神经系统，进而释放大量炎症介质、活化中枢宿主免疫细胞进一步募集外周淋巴细胞进入中枢，最终导致炎症介质大量释放及髓鞘脱失甚至轴突损伤。在整个免疫激活过程中，淋巴细胞呼吸暴发将产生大量的氧自由基，因此氧化应激也参与了EAE中枢神经系统脱髓鞘过程中。已有多个研究提示，氢气对抗氧化应激中的显著作用，如对脑脊髓[9]的缺血再灌注损伤、脑外伤[10]、脓毒血症[11]、帕金森病[4]、心肌细胞缺血再灌注损伤[12]等均有保护作用，均提示其在抗氧化应激中的作用。

本研究结果发现，氢气可以抑制大鼠EAE发病过程中体重的下降，降低发病大鼠的神经行为学缺损评分；这表明氢气可能在EAE发病的免疫启动到免疫攻击阶段发挥了调节作用，抑制了免疫细胞，免疫因子对髓鞘的损伤作用；神经缺损症状较重的大鼠主动摄食、摄水能力下降，而饲养员辅助给予饵料仍能进食，说明大鼠发病时食欲并未完全丧失，只是丧失了摄食能力。因此，大鼠体重改变可能是神经行为缺损严重度的间接反映，但氢气是否对大鼠EAE发病期间食欲以及能量代谢有调节作用仍有待经一步研究证实。氢气饱和生理盐水减少了炎症细胞在中枢的浸润：H-EAE组大鼠中枢炎症反应较轻，而EAE组较重，CFA组则未发现中枢炎症反应。在EAE组可以发现大量淋巴细胞浸润于脊膜下和小血管周围，甚至形成典型的血管袖套，而HEAE组多为脊膜下淋巴细胞浸润，甚少见到典型血管袖套。HE染色评分发现，EAE组大鼠评分高于H-EAE组。CD3分子是T细胞的表面标记物，正常中枢组织很少有T细胞存在。CD3免疫组织化学染色可以发现EAE发病大鼠中枢浸润T细胞数，H-EAE组少于EAE组，这说明氢气可以抑制T细胞浸润中枢，但它是在免疫反应过程中那个阶段发挥效应仍不明确。进一步研究发现，氢气还提高H-EAE组大鼠血清SOD活性而增强其抗氧化应激能力；在免疫效应阶段，髓鞘损伤过程中，存在这氧化应激，因此SOD活性的增强可以减轻氧化应激损伤。

此外，本研究还发现，氢气能下调脊髓炎症部位IL-17、INF-γ表达水平，而IL-17、INF-γ是促炎因子，因此氢气有可能抑制炎症细胞释放这些促炎因子的释放而发挥抗脱髓鞘损伤作用，然而其是否为直接通过气体分子信号系统调节淋巴细胞的炎症介质释放还是间接的抑制Th17细胞、Th1细胞等活化释放炎症介质尚不明确。有研究发现，IL-17与EAE的发病有密切关系，认为它主要是Th17细胞分泌的一种促炎因子，其表达水平的高低与EAE发表严重程度呈现正相关[13-14]；而IL-10可以抑制EAE的发病[15]，它主要由Treg细胞合成分泌。本研究发现氢气对EAE的保护作用不是通过促进IL-10的释放而实现的；在EAE发病过程中EAE组大鼠与H-EAE大鼠SOD水平均下降，而CFA组动物没有明显改变，提示EAE发病过程中存在氧化应激可能。

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Effects of hydrogen-rich saline on experimental autoimmune encephalomyelitis in rat and its mechanism

ObjectiveTo investigate the effects of hydrogen-rich saline on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)in rat and its mechanism．Methods EAE was induced by injection of spinal cord homogenate of guinea pig containing CFA into hind limb footpads in SD rsts．hydrogen-rich saline(6ml/kg,study group)or same volume normal saline(control group) were injected intraperitoneally 5-17d after EAE induced．all rats were sacrificed 20d after EAE induced and paraffin sections were prepared and stained with hematoxylin-eosin．Rabbit anti-CD3 polyclonal antibody was used to detect inflammatory T cell infiltration．The spinal tissue levels of IL-17,IL-10 and INF-γwere determined by ELISA and serum SOD was also determined．Results The animal weight lost and neurobehavioral deficits were attenuated in study group,compared to control group．There were less inflammatory cells detected in study group than those in control group．Compared to control group the tissue levels of IL-17 and INF-γ were decreased and the SOD activity was increased in study group．Conclusion Hydrogen-rich saline may reduce the severity of EAE by increasing SOD activity and decreasing IL-17 and INF-γ levels．

Hydrogen Experimental autoimmune encephalomyelitis SOD IL-17 IL-10 INF-γ