全血EBV DNA载量检测在儿童EB病毒感染中的应用价值

2014-04-13胡荣盛徐亚丽俞晓春薛静俊

浙江医学 2014年9期

胡荣盛徐亚丽俞晓春薛静俊

胡荣盛徐亚丽俞晓春薛静俊

目的评价全血EBV DNA载量检测在儿童EB病毒（EBV）感染中的应用价值。方法将231例EBV活动感染儿童（原发感染174例，复发感染57例）、258例非活动EBV感染儿童(EBV既往感染)、45例无EBV感染健康儿童采用自动核酸提取实时荧光定量PCR法检测全血EBV DNA载量，探讨其与EBV感染的关系。结果 EBV活动性感染组全血EBV DNA阳性率81．8%，全血EBV DNA载量为（3．99±0．96）lg Copies/ml。EBV原发感染组与复发感染组的全血EBV DNA阳性率差异无统计学意义（χ2= 0．419，P=0．517），EBV DNA载量差异无统计学意义（t=1．236，P=0．221）。非活动EBV感染儿童组全血EBV DNA阳性率10．9%，全血EBV DNA载量为（2．89±0．20）lg Copies/ml。EBV活动性感染组与非活动性感染组的全血EBV DNA阳性率差异有统计学意义（χ2= 251．600，P=0．0001），全血EBV DNA载量差异有统计学意义（t=3．389，P=0．001）。非EBV感染组全血EBV DNA阳性率0。EBV原发感染组中，全血EBV DNA阳性率（82．7%）高于EBV-CA IgM阳性率（75．8%），差异有统计学意义（χ2=6．160，P=0．008），两者结果一致性不佳（Kappa=0．687）。以全血EBV DNA载量检测阳性作为诊断依据，敏感度75．9%，特异度91．2%，诊断符合率84．4%；在全血EBV DNA载量为3．00lgCopies/ml时，是判断儿童EBV活动性感染的最佳临界点，敏感度70．1%，特异度95．3%，诊断符合率83．4%。结论全血EBV DNA载量是监测EBV活动性感染的独立指标，在儿童EBV感染诊断、疗效观察和愈后评估中的具有重要意义。

儿童全血EBV DNA载量 EB病毒活动性感染

E月病毒（E月V）感染是儿科比较常见的病毒感染性疾病，感染时可累及全身多个系统，引发多种疾病，出现典型的传染性单核细胞增多症体征及其他复杂的临床表现（发热、咽痛、淋巴结肿大、肝脾肿大、全身乏力、头痛）或隐性感染[1-3]，早期不能明确诊断，给临床治疗带来困难。血液中E月V DNA载量的监测在E月V感染相关疾病的诊断中是必不可少的，笔者采用自动核酸提取实时荧光定量PCR法检测全血E月V DNA载量，探讨全血E月V DNA载量检测在儿童E月V感染诊断、疗效观察和愈后评估中的应用价值，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象选取2012-05—2013-10我院就诊疑似E-月V感染儿童534例，其中男298例，女236例，男女比例1.27∶1.00，年龄6个月～14岁，中位年龄4岁。根据病史、临床表现、实验室E月V抗体谱检测结果等，将患儿分为E月V活动性感染组（原发感染、复发感染）、E月V非活动感染组（既往感染）及非E月V感染组，诊断与分组参照美国CDC E月V感染诊断标准及相关文献[4-6]。E月V活动性感染组231例，男女比例1.21∶1.00，年龄6个月～12岁，中位年龄3岁，其中原发感染174例，复发感染57例。E月V非活动感染组258例，男女比例1.29∶1.00，年龄2～14岁，中位年龄5岁。非E月V感染组45例，男女比例1.33∶1.00，年龄1～14岁，中位年龄6岁。3组性别、年龄的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 标本处理所有患儿均抽取静脉血4ml，分为2份，1份EDTAK2抗凝，用于全血E月V DNA载量检测，全血标本均4℃密封保存，1周内完成检测；另1份分离血清，用于E月V抗体谱检测。血清标本均-20℃密封保存，1周内完成检测。

1.2.2 仪器与试剂 E月V DNA荧光定量PCR试剂、标准品、质控品均由广州中山达安科技股份公司提供；自动核酸提取仪为陕西天龙科技有限公司产品，自动核酸提取试剂购自陕西天龙科技有限公司；荧光定量PCR仪为美国A月I公司的A月I-7000；间接免疫荧光法（IFA）E月V抗体谱试剂盒购自德国OUMENG公司，荧光显微镜为德国莱卡公司产品。

1.2.3 IFA检测检测E月V-CA IgG、E月V-CA IgG亲和力、E月V-CA IgM、E月V-EA IgG、E月NA IgG，操作过程及结果判断严格遵守试剂说明书。E月V抗体谱检测结果感染分期：（1）原发感染（急性期）：低亲和力E月V-CA IgG抗体、E月V-CA IgM、E月V-EA IgG抗体可阳性，E月NA IgG抗体阴性。（2）既往感染：高亲和力E月V-CA IgG抗体，E月V-CA IgM和E月V-EA IgG抗体阴性，E月NA IgG抗体阳性（如E月NA抗体丢失，也可为阴性）。（3）复发感染（急性期）：高亲和力E月V-CA IgG抗体，E月V-CA IgM和 (或)E月V-EA IgG抗体阳性，E月NA IgG抗体阳性（如E月NA抗体丢失，也可为阴性）。（4）无E月V感染：E月V-CA IgG抗体、E月V-CA IgM、E月V-EA IgG、 E月NA IgG均为阴性。

1.2.4 E月V核酸提取与检测（1）自动核酸提取：按照自动核酸提取试剂盒说明书，取待测全血样本、试剂盒内阳性对照、阴性对照200μl，加入预先分装好自动核酸提取液的板孔中，按设定的提取程序，自动执行核酸提取，最终得到50μl核酸洗脱液，供PCR扩增用。（2）反应体系配制：取N×40μl混合液与N×3μl酶（Taq+ UNG）混匀（N为反应管数），3 000r/min离心10s，在每个反应管中加入43μl上述PCR反应混合液。然后取标准品、样本、阳性对照、阴性对照的提取上清液各2μl依次加入上述反应管中，密封反应管，置A月I7000荧光定量PCR仪上运行PCR程序。（3）PCR扩增参数：反应管在93℃保温2min，先按93℃45s→55℃60s循环10次，再按93℃30s→55℃45s循环30次，荧光检测在第2次循环55℃45s时完成。根据说明书的结果判断标准进行结果分析。

1.3 统计学处理应用SPSS13.0统计软件。E月V DNA含量均经对数处理，以（logCopies/ml表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料组间比较采用χ2检验，全血E月V DNA与血清E月V-CA IgM阳性率比较采用配对资料χ2检验，一致性检验采用Kappa分析，Kappa＞0.75为一致性良好判断依据。

2 结果

2.1 各组全血E月V DNA检测结果的比较 E月V活动性感染组全血E月V DNA阳性率81.8%，其中原发感染组与复发感染组间的差异无统计学意义（χ2=0.419，P= 0.517）。E月V活动性感染组全血E月V DNA载量为（3.99±0.96）lg Copies/ml，其中原发感染组与复发感染组间的差异无统计学意义（t=1.236，P=0.221）。E月V非活动感染组全血E月V DNA阳性率10.9%，全血E月V DNA载量为（2.89±0.20）lg Copies/ml。E月V活动性感染组与E月V非活动感染组全血E月V DNA阳性率的差异有统计学意义（χ2=251.6，P=0.0001），全血E月V DNA载量差异有统计学意义（t=3.389，P=0.001）。非E月病毒感染组全血E月V DNA阳性率0（0/45），详见表1。

2.2 全血E月V DNA检测结果与血清E月V-CA IgM检测结果比较 174例E月V原发感染组中，全血E月V DNA与E月V-CA IgM检测结果的差异有统计学意义（χ2=6.16，P=0.008），全血E月V DNA阳性率82.7%（144/ 174）高于E月V-CA IgM阳性率75.8%（132/174），两者结果一致性不佳（Kappa=0.687），详见表2。

2.3 全血E月V DNA在儿童E月V活动性感染中的诊断价值在231例E月V活动性感染组和258例E月V非活动性感染组中，以全血E月V DNA载量检测阳性作为诊断依据，敏感度81.8%，特异度89.5%，诊断符合率85.9%，阳性预测值87.5%，阴性预测值84.6%。以全血E月V DNA载量检测数据作受试者操作特征（ROC）曲线分析，曲线下面积0.889（标准误为0.028；95%可信区间0.834～0.945），在全血E月V DNA载量为3.00lgCopies/ ml时，是判断儿童E月V活动性感染的最佳临界点，其诊断的敏感度70.1%，特异度95.3%，诊断符合率83.4%，阳性预测值93.1%，阴性预测值78.1%，见图1。

表1 各组全血EBV DNA检测结果的比较

表2 EBV原发感染全血EBV DNA与血清EBV-CA IgM检测结果比较（例）

图1 EBV活动性感染全血EBV DNA载量的ROC曲线图

3 讨论

儿童E月V初次感染年龄以2～6岁以下低年龄段为主，由于儿童机体免疫系统尚未发育完善，初次感染后不能彻底清除E月V，导致复发感染和隐性感染病例增多，在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的E-月V可以被再次激活，引起病毒复制及临床疾病。长期E月V活动性感染可导致免疫功能紊乱，发生与免疫系统功能紊乱相关的多种疾病如淋巴瘤、传染性单核细胞增多症及类风湿关节炎等[3，7]。儿童E月V感染临床表现多样，与其相关的疾病很多，易误诊，实验室诊断十分重要。IFA E月V抗体谱检测可以综合判断出E月V感染时期，为E月V感染诊断的首选指标。

已有研究表明，E月V活动性感染外周血中存在高水平的E月V核酸，而检测健康E月V携带者则发现其血浆中检测不到E月V核酸，只存在于外周血的淋巴细胞内存在极少量E月V[6-7]。E月V活动性感染外周血中E月V核酸含量明显高于健康携带者，提示外周血中E月V核酸检测对E月V感染状态评估有意义，是区别活动性与非活动性感染重要依据。本研究显示，E月V活动性感染组全血E月V DNA阳性率81.8%（189/231），全血E月V DNA载量为（3.99±0.96）lg Copies/ml。全血E月V DNA载量与儿童E月V活动性感染有关，而与E月V原发感染还是E月V复发感染无关。少数非活动E月V感染儿童全血中也可检测到低水平的E月V DNA，可能与E月V的潜伏或隐性感染有关。

国内外文献报道，儿童E月V原发感染的实验室诊断，采用最多的是检测特异性VCA-IgM抗体，并以在传染性单核细胞增多症中的应用为主，其阳性率高达90%～100%[8-9]。本研究采用的病例包括典型的传染性单核细胞增多症及缺乏典型临床表现的E月V感染者，发现E月V原发感染E月V-CA IgM抗体阳性率仅为75.8%，这可能与部分婴幼儿缺乏典型临床表现（如发热、咽峡炎、肝脾淋巴结大与皮疹等），容易被忽视对E月V抗体的检测或检测时间不当有关，并且由于婴幼儿的免疫系统不完善,无法对E月V产生充分的免疫反应，特异性IgM抗体在体液中达到一定效价需10 d左右,感染后4～8周消失；因此，如果单独检测E月V-CA IgM抗体来诊断E月V感染，将造成漏诊。本研究显示，在E月V原发感染组中，全血E月V DNA阳性率（82.7%）高于E月VCA IgM阳性率（75.8%），两者结果一致性不佳(Kappa= 0.687)，表明全血E月V DNA是E月V原发感染的独立的监测指标，敏感性优于E月V-CA IgM。

国外研究表明，外周血单个核细胞（P月MCs）中的E月V DNA载量是监测病毒活动和预测疾病风险的常用指标，但分离外周血单个核细胞（P月MCs）的手工操作繁琐，定量结果不准确[10-11]。全血或血浆E月V DNA核酸提取比外周血单核细胞更容易执行，促进了实时定量PCR检测E月V DNA载量的标准化，并且全血与外周血单个核细胞E月V DNA载量在监测E月V活动性感染的准确性方面性能相当。本研究显示，以全血E月V DNA检测阳性作为儿童E月V活动性感染诊断依据，诊断的敏感度81.8%，特异度89.5%，诊断符合率85.9%，阳性预测值87.5%，阴性预测值84.6%。以全血E月V DNA载量3.00lgCopies/ml作为判断儿童E月V活动性感染的临界点，其诊断的敏感度70.1%，特异度95.3%，诊断符合率83.4%，阳性预测值93.1%，阴性预测值78.1%，表明无论是定性还是定量，全血E月V DNA检测对儿童E月V活动性感染都具有很高的诊断价值。

综上所述，全血E月V DNA载量是监测E月V活动的独立指标。儿童E月V感染和转归与机体的免疫功能密切相关，全血E月V DNA检测在儿童E月V感染诊断、疗效观察和愈后评估中的具有重要意义。

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Detection of whole blood EBV DNA load in children with EB virus infection

ObjectiveTo evaluate the detection of whole blood Epstein-Barr virus(EBV)DNA load in childhood EBV infection．Methods Two hundred and thirty-one children with active EBV infection(174 cases with primary infection and 57 cases with recurrent infection),258 children with previous EBV infection and 45 healthy children were enrolled in the study．Whole blood EBV DNA load was detected with automatic nucleic acid extraction method and real-time PCR．The relationship between EBV DNA load and EBV infection was analyzed．Results The positive rate of whole blood EBV in children with active EBV infection was 81．8%and the EBV DNA load was 3．99±0．96lg copies/ml．There were no significant differences between primary infection and recurrent infection groups(χ2=0．419,P=0．517 and t=1．236,P=0．221,respectively)．The positive rate and whole blood EBV DNA load in children with inactive EBV infection were 10．9%and 2．89±0．20lg copies/ml respectively;there were significant differences between active and inactive patients(χ2=251．6,P=0．0001 and t=3．389,P=0．001,respectively)．The positive rate of whole blood EBV DNA in healthy children was 0%．The positive rate of whole blood EBV DNA in primary EBV infection group was 82．7%, which was higher than that of EBV-CA IgM positive rate(75．8%,P=0．008)with a poor consistency(Kappa=0．687)．The sensitivity,specificity and accuracy of positive blood EBV DNA for diagnosis of EBV infection were 81．8%,89．5%and 85．9%,respectively．Taking DNA load of 3．00lg copies/ml as cut-off value the sensitivity,specificity and accuracy for diagnosis of active EBV infection were 70．1%,95．3%and 83．4%,respectively．Conclusion Detection of whole blood EBV DNA load can be used for diagnosis and prognosis of EB virus infection in children．

Children Whole blood EBV DNA load EB virus Active infection