Ku80在人肺癌中的表达水平与放疗前后表达变化的实验研究

叶健 王利民 王娇莉 金儿

Ku80在人肺癌中的表达水平与放疗前后表达变化的实验研究

叶健 王利民 王娇莉 金儿

目的基于Ku80在辐射诱导的DNA修复中的作用，研究不同病理类型肺癌中Ku80的表达水平，并以人肺癌A549细胞接种裸鼠模型评估放疗对Ku80表达的影响。方法 使用免疫组化及荧光定量PCR分别检测不同病理类型肺癌Ku80蛋白和mRNA的表达水平。将A549细胞接种到裸鼠上再以不同剂量的射线照射，并分别在24、48h后处死，用免疫组化及荧光定量PCR检测Ku80蛋白和mRNA的表达水平。结果 肺癌组织表达的Ku80蛋白、mRNA水平高于正常肺组织（均P＜0．01）。在肺癌亚组中，肺腺癌和鳞癌比小细胞肺癌表达更高的Ku80蛋白、mRNA水平（均P＜0．01）。接种在裸鼠的人肺癌A549细胞经过不同剂量射线照射后Ku80 mRNA的表达增加，并具有剂量和时间依赖性。结论 Ku80在放疗引起的DNA破坏过程中起到重要的作用。肺鳞癌和腺癌的Ku80表达高于小细胞肺癌，这可能是肺鳞癌和腺癌放射敏感性逊于小细胞肺癌的原因之一。Ku80表达水平可能在预测肺癌的放射敏感性方面具有重要价值，可以成为肺癌放射增敏治疗的一个新靶点。

Ku80 肺癌 人肺癌A549细胞 放疗

肺癌已居全球恶性肿瘤病死率的首位，目前的5年生存率＜15%，对人类健康构成了很大的威胁[1-2]。放疗是目前肺癌治疗中的一个非常重要的策略。放疗能够造成肿瘤细胞DNA破坏、细胞周期阻滞和细胞凋亡。然而Komuro等[3]研究发现癌细胞的放疗抵抗性是导致部分患者放疗效果不佳的重要原因。目前已证实不同的病理类型的肺癌有不同的放射敏感性，而且对放射损伤的修复能力也存在差异[4-5]。Ku蛋白是由Ku80与Ku70两亚基紧密结合形成的异二聚体结构，在电离辐射造成的双链DNA断裂（DSBs）的同源末端结合和非同源末端结合修复途径中发挥重要作用。Pucci等[6]通过研究发现Ku蛋白的表达在人侵袭性乳腺癌和膀胱癌细胞中明显高于正常细胞。由于不同病理类型的肺癌对放疗的敏感性以及放疗对DNA的破坏路径不同，本研究选择对不同病理类型的肺癌进行对比研究，以探讨不同类型肺癌Ku80表达的差异以及其表达水平与放疗照射剂量和照射时间的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 24例标本均来源于2008-01—2009-10本院肺癌手术患者。其中男14例，女10例，年龄40～73岁，平均57.3岁。所有患者入院前均未进行任何抗肿瘤治疗。依据2004年WHO肺肿瘤组织病理学分类标准[7]，其中腺癌10例、鳞癌8例、小细胞癌6例，同时设置对照组6例。3种类型的患者平均年龄分别为（53.20±9.65）、（65.63±5.93）和（53.00±9.01）岁；鳞癌患者的年龄与另外两组比较均有统计学差异（均P＜0.05）；3组患者在性别和肿瘤分期上均无统计学差异（均P＞0.05）。肺癌组织取自标本中肿块中央的非坏死部分；对照组则为标本中距肿块5cm以上的肺组织，均经病理证实为正常肺组织。组织离体后用剪刀分离成2小块，放入-70℃冰箱备用，分别行免疫组化和荧光定量PCR检测。

1.2 实验动物和细胞系 4周龄健康SPF级雌性BALB/c裸鼠42只，体重（20±5）g，购买并饲养于浙江中医药大学动物中心。人肺腺癌细胞系A549细胞由浙江中医药大学实验中心提供。

1.3 主要试剂和设备 Ku80兔多克隆抗体购于美国BioWorld technology公司，免疫组织化学二步法试剂（pv-6002试剂盒）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，反转录试剂盒购自日本TAKARA公司。荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，医用图像分析软件购自德国Carl Zeiss公司，放疗直线加速器型号为德国西门子公司产品，型号Siemens mevatron KD2。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化检测Ku80蛋白的表达 各组标本经4%多聚甲醛固定过夜，常规石蜡包埋、切片后，通过免疫组化即用型二步法检测Ku80蛋白的表达。切片置60℃烘烤，脱蜡；高压热修复后分别滴加浓度为1∶100的一抗和二抗；DAB显色；复染、透明后封片；用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：以细胞核内呈现淡黄、棕黄或者棕褐色颗粒为Ku80蛋白阳性反应，阴性对照除细胞核染成蓝色外，核内无棕黄色反应物。采用Carl Zeiss Imaging Systems高清晰度彩色病理图文报告管理系统对Ku80蛋白表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度，同时测定阳性反应面积和细胞总面积并计算阳性面积率，阳性面积率=阳性反应面积/细胞总面积×100%。每例以5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

1.4.2 荧光定量PCR检测Ku80 mRNA的表达 Ku80引物序列上游：5′-TGGTGCGGTCGGGGAATA-3′，下游：5′-CAGAAAGGGGATTGTCAGTGC-3′，扩增片段207bp。β-actin引物序列上游：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，扩增片段186bp。扩增程序：94℃5min，94℃15s，60℃45s，共40个循环。60℃检测荧光值，行熔解曲线实验。将对照组的Ku80表达设定为1.000，并按此确定各实验组Ku80的相对表达量，通过比较各组2-△△CT值（2-△△CT表示的是各组肺癌组织Ku80基因的表达相对于对照组的变化倍数）[8]，进行定量分析。

1.4.3 动物实验 A549细胞以含10%小牛血清的DMEM培养液培养。收集对数生长期的A549细胞，调整细胞密度为5×107个/ml。将细胞悬液0.2ml注射于裸鼠左下肢外侧皮下。于接种后3周，皮下瘤组织长至约1cm×1cm大小时对负瘤裸鼠进行照射。

42只雌性裸鼠以简单随机法分为7组，每组6只。第1组为对照组，不行照射；第2～7组为照射组；第2组以1Gy的强度照射后24h处死取瘤；第3组以1Gy的强度照射后48h处死取瘤；第4组以4Gy的强度照射后24h处死取瘤；第5组以4Gy的强度照射后48h处死取瘤；第6组以8Gy的强度照射后24h处死取瘤；第7组以8Gy的强度照射后48h处死取瘤。瘤组织用剪刀分成2小块，分别以免疫组化和荧光定量PCR测定Ku80蛋白和mRNA的表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件，计量资料以表示，各裸鼠组和肺癌患者组均为小样本，组间比较采用非参数的Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney检验；对照组和各实验组间比较采用非参数Wilcoxon符号秩检验；计数资料组间比较采用Pearson χ2和Fisher检验。

2 结果

2.1 不同病理类型患者肺癌组织中的Ku80蛋白和mRNA的表达 免疫组化显示Ku80蛋白在对照组低表达；在腺癌组织中呈阳性表达，棕黄色颗粒位于细胞核内；在鳞癌组织中也为阳性表达，棕黄色颗粒位细胞核内，呈团块或弥散分布；在小细胞肺癌组织也呈阳性表达（图1，见插页）。各肺癌组Ku80的阳性面积率均明显高于对照组，且小细胞肺癌Ku80的阳性面积率明显低于腺癌和鳞癌（均P＜0.01）。对照组和肺癌组的平均光密度无统计学差异；3种不同类型肺癌组的平均光密度比较也无统计学差异（均P＞0.05）。各肺癌组Ku80的2-△△CT值均明显高于对照组，小细胞肺癌Ku80的2-△△CT值明显低于腺癌和鳞癌（均P＜0.01），说明小细胞肺癌患者的Ku80 mRNA的表达水平明显低于腺癌和鳞癌。Ku80蛋白和mRNA表达与肺癌患者临床特征的关系见表1，荧光定量PCR扩增产物凝胶电泳见图2。

表1 Ku80在不同病理类型肺癌组织中表达与患者临床特征的关系

图1 免疫组化检测不同病理类型肺癌中Ku80的表达（A：正常肺组织；B：肺腺癌；C：肺鳞癌；D：小细胞肺癌；免疫组化二步法

图2 荧光定量PCR扩增产物凝胶电泳

2.2 异种移植负瘤小鼠A549细胞中Ku80的表达

2.2.1 负瘤小鼠A549细胞中Ku80的蛋白表达 第2～7组Ku80的阳性面积率和平均光密度均显著高于对照组（均P＜0.05）。较长照射时间组阳性面积率和平均光密度更高；接受相同时间照射的组间比较，照射剂量更强的Ku80蛋白表达更高（均P＜0.05），见表2。对照组未照射负瘤小鼠A549细胞中Ku80蛋白主要表达于细胞核，呈棕黄色团块或弥散分布，少数细胞质也有表达；第2组1Gy射线照射后24h，A549细胞核的Ku80蛋白棕黄色颗粒较第1组颜色加深；随着照射时间延长，负瘤小鼠A549细胞中Ku80的蛋白表达呈升高趋势（图3，见插页）。

2.2.2 负瘤小鼠A549细胞中Ku80的mRNA表达 第2～7组Ku80的2-△△CT值均显著高于对照组（均P＜0.01）。接受相同照射时间的组间比较，照射剂量更强组的Ku80 mRNA表达更高；接受相同照射剂量的组间比较，较长时间照射组mRNA表达更高（均P＜0.01），见表2。

图3 免疫组化检测负瘤小鼠的Ku80在照射前后的表达变化（A：未照射组；B：1Gy照射后24h；C：8Gy照射后24h；D：8Gy照

表2 不同剂量和时间照射后各组负瘤小鼠A549细胞Ku80蛋白及mRNA表达

3 讨论

Ku蛋白在电离辐射造成的DNA断裂修复途径中发挥重要作用。本研究评估了肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌和正常肺组织中Ku80的表达情况，发现肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌的Ku80蛋白表达主要位于细胞核，而且相对于肺腺癌和鳞癌细胞，正常肺组织和小细胞肺癌的Ku80蛋白和mRNA表达水平明显减低，与既往报道的肺腺癌和肺鳞癌的放疗效果低于小细胞癌是一致的[4-5]。

通过将人肺腺癌A549细胞接种裸鼠构建负瘤裸鼠模型，再以不同强度的射线照射后24、48h处死，笔者发现Ku80表达水平的增加呈剂量和照射后时间依赖性。考虑到Ku80蛋白在照射引起的DNA损伤修复中的作用，这些结果可以用来解释肺腺癌和肺鳞癌放射敏感性不如小细胞肺癌的原因。本研究结果与Shintani等[9]报道的体外实验显示照射口腔鳞癌细胞导致Ku80蛋白表达上调，从而引起细胞放疗抵抗一致。

DSBs是最有杀伤力的DNA破坏方式，Harper等[10]研究发现要维持基因组的完整首先需要修复断裂的DNA。DSBs是细胞暴露在损伤因素下如电离辐射等的主要结果，未修复的DSBs引起细胞周期阻滞促使细胞进入死亡程序。Willmore等[11]已证实Ku80蛋白作为DNA修复蛋白，在DSBs的同源和非同源末端结合修复途径中发挥重要作用。系列研究证实Ku缺失在不同细胞系的放射增效作用，用siRNA的方法敲除人宫颈癌Hela细胞、直肠癌HCT116细胞和乳腺上皮MCF10A细胞中的Ku后均表现出放射敏感性增加[12-13]。Zhang等[14]通过抑制剂下调人肺癌A549细胞的Ku80也起到了放疗增效的作用，原因可能与抑制DNA修复复合体（DNA-PK）的形成，从而阻止了DNA修复有关。

最近的研究聚焦在Ku基因的表达和功能以及它在肿瘤发生、发展中的作用。Muller等[15]研究发现增加Ku80蛋白的表达可以显著增加慢性淋巴细胞白血病和骨髓瘤小鼠造血细胞的放疗抵抗。胃癌细胞内的Ku70/Ku80蛋白表达增高存在COX-2依赖性，通过COX-2抑制剂可以减低Ku80表达从而抑制细胞增殖[16]。在人直肠癌细胞中抑制Ku80表达可以抑制细胞增殖并导致其凋亡[17]，下调Ku80表达还可增强肺癌细胞的放射敏感性，增强射线对DNA的破坏[18]。引入反义Ku70进入人肺鳞癌细胞系可以增强细胞的放、化疗敏感性[19]。以上研究说明Ku蛋白是一个潜在的治疗新靶点，调节Ku的水平可能是克服肿瘤放疗抵抗的有效策略，并能起到放疗增效的作用。

综上所述，本研究结果显示Ku80的表达水平在临床上可能用于预测不同类型肺部肿瘤的放射敏感性。体内试验则显示人肺癌A549细胞经过不同剂量射线照射后的Ku80表达增加呈剂量和照射后时间依赖性，提示了Ku80在放疗引起的DNA破坏的修复过程中可能起到重要的作用。但由于本研究样本较小，因此有一定的局限性。以后的研究中，将在分子水平进一步研究Ku80基因的表达和作用，并将在大样本的肺癌人群中探索抑制Ku80表达与放疗增效间的关系。此外，探索年龄对Ku80表达的影响也将是一个很有意义的研究。

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Ku80 expression in lung cancer patients and nude mice bearing human lung carcinoma before and after irradiation

ObjectiveTo investigate Ku80 expression in lung cancer patients and nude mice bearing human lung carcinoma before and after irradiation． Methods Cancer tissue and pericancerous tissue specimens were collected from 24 lung cancer patients,including 10 cases of lung adenocarcinoma，8 cases of lung squamous carcinoma and 6 cases of small-cell lung carcinoma．Human lung cancer A549 cells were inoculated in BALB/c nude mice and the tumor-bearing mice were exposed to varying doses of irradiation．Immunohistochemistry and real-time PCR were applied to determine Ku80 protein and mRNA expression,respectively． Results Lung carcinoma tissue exhibited higher Ku80 mRNA and protein levels when compared with normal tissue(P＜0．01)．Lung adenocarcinoma and lung squamous carcinoma showed higher levels of Ku80 protein and mRNA,compared with small-cell lung carcinoma (P＜0．01)．There was a dose-dependent and time-dependent increase in Ku80 mRNA levels in tumor-bearing nude mice exposed to varying doses of irradiation．Conclusion Ku80 may be involved in DNA damage repairing,and higher Ku80 levels in non-small cell lung cancer may be associated with its lower radiosensitivity．The results indicated that Ku80 expression levels could be useful in predicting radiosensitivity of lung cancer and Ku80 may be used as a target to improve radiosensitivity in lung cancer patients．

Ku80 Lung carcinoma A549 cellRadiotherapy

2013-12-25）

（本文编辑：胥昀）

杭州市医药卫生科技计划项目（2012A002）

310006 杭州市第一人民医院呼吸内科