RNA干扰技术干涉后核糖体蛋白S15a在胃癌中的表达及意义

2014-04-13刘勇攀石定王泽军于香

浙江医学 2014年15期

刘勇攀石定王泽军于香

刘勇攀石定王泽军于香

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术干涉后核糖体蛋白S15a（RPS15a）在胃癌中的表达及意义。方法选取12例胃癌患者手术切除的胃癌组织，利用RNAi干涉RPS15a基因，将小片段克隆到质粒中，分别提取质粒后转染胃癌细胞BGC823。将未转染、随机小片段转染非编码序列、siRPS15a-1转染、siRPS15a-2转染的BGC823细胞分为BGC823-WT组、siNC组、siRPS15a-1组、siRPS15a-2组，RT-PCR法及Western blot分别检测各组RPS15a RNA及蛋白的表达情况，流式细胞仪检测细胞增殖的变化。结果RNAi后细胞中出现了明显的绿色荧光，提示此转染方式是可行的。转染检测结果表明，本实验提取的RNA未受到质粒DNA的污染，可以进行表达的比较。siRPS15a-1组、siRPS15a-2组RNA及蛋白表达相对灰度比值与BGC-WT组、siNC组比较，差异均有统计学意义（均P＜0．05），BGC-WT组与siNC组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。RNAi后细胞增殖速度显著下降，多数细胞集中在G0/G1期。结论RNAi技术不仅可以下调RPS15a在胃癌中表达，而且还可以抑制胃癌细胞的增殖活性。

核糖体蛋白 S15a 胃癌 RNA干扰

胃癌是最主要的恶性肿瘤类型之一，分子生物学研究表明癌基因、抑癌基因和细胞周期控制基因的异常表达参与了胃癌的发生、发展。核糖体蛋白S15a（ribosomal protein S15a，RPS15a）是核糖体蛋白家族中的一员，在蛋白质的生物合成中起重要作用。近年来，越来越多的证据表明RPS15a除组成核糖体促进蛋白质的生物合成，参与细胞的增殖、分化、凋亡外，还具有独立于蛋白质生物合成作用之外的功能，尤其是参与肿瘤的发生、发展的已引起广泛重视，但其具体的作用机制尚不清楚。本研究应用RNA干扰（RNAi）技术对RPS15a的表达进行干涉，旨在探讨该基因对胃癌发生、发展的影响。

1 材料和方法

1.1 材料选取2006-03—06在我院接受手术治疗的胃癌患者12例，男7例，女5例，年龄49～76岁，平均61.4岁。所有患者均以手术切除的癌组织及癌旁正常组织（距离癌组织约5cm）进行对照分析，组织离体后立即在液氮中速冻，并置于-70℃冰箱中保存。

1.2 试剂和仪器 RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，荧光差异显示试剂盒购于Genhunter公司，SuperScriptⅡ反转录试剂盒购于Gibco公司，荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司。荧光差异显示系统（HITACHI公司生产），STRATAGENE MX3000P荧光定量PCR仪（Eppendorf公司生产），GenspecⅢ（HITACHI公司生产）。RPS15a的定量PCR及内参所选用的引物序列由Ambion公司设计。

1.3 方法

1.3.1 cDNA的制备以Trizol提取的方法提取胃癌组织、癌旁组织及细胞总RNA并纯化，用MMLV反转录得到胃癌和癌旁组织以及胃癌细胞的cDNA。提取的总RNA进行凝胶电泳及Gene SpecⅢ检测。

1.3.2 荧光定量PCR分析利用DNAstar软件设计用于荧光定量PCR的RPS15a基因引物，内参选用人βactin（GenBank登录号：AK225414），检测RPS15a基因在胃癌组织、癌旁组织中的表达差异，引物序列见表1。反应条件为94℃40s，58℃35s，72℃40s。

表1 引物序列

1.3.3 RPS15a的RNAi、分组及表达变化的检测将RPS15a的序列提交到Ambion公司，由专业软件设计了2条序列（siRPS15a-1：GCA AAC GCC AGG TGC TTA TTA；siRPS15a-2：GAT GAT GAA GCA TGG TTA CAT），以随机小片段作为参照。RNAi的小片段也由Ambion公司合成。将小片段克隆到质粒中，分别提取质粒后转染胃癌细胞BGC823，通过荧光显微镜观察共表达的绿色萤光蛋白，检测转染效率。将未转染、随机小片段转染非编码序列、siRPS15a-1转染、siRPS15a-2转染的BGC823细胞分为4组，分别为BGC823-WT组、siNC组、siRPS15a-1组、siRPS15a-2组，然后从其细胞中提取RNA，采用RT-PCR进行RPS15a表达变化的分析。

1.3.4 RPS15a蛋白水平的检测收集处理后的BGC细胞，提取总蛋白进行Western blot检测RPS15a蛋白水平。

图2 BGC细胞转染干扰质粒，GFP表达检测BGC-WT：BGC细胞未经转染；siNC：BGC细胞转染非编码序列，作为阴性对照

1.3.5 RPS15a RNAi后对细胞生长的影响收集RNAi后的RPS15a细胞，行Brdu染色及流式细胞术检测细胞周期的变化和细胞增殖的影响。在此基础上进行克隆形成的比较实验，转染的细胞在软琼胶的平板上生长后，对细胞进行染色了解细胞生长情况。

1.4 统计学处理采用SPSS13.0统计软件，计量资料以表示，两组间的比较采用t检验。

2 结果

2.1 RPS15a差异表达验证结果凝胶电泳结果显示，

28S和18S条带较为明显，总RNA的完整性和质量较好。采用Gene SpecⅢ检测进一步证实，A260/A280值均在1.9～2.0，结果与电泳结果一致，各项指标均达到反转录要求。对RPS15a基因在癌组织及相应癌旁组织中的表达量进行荧光定量分析（见图1），发现RPS15a基因在胃癌组织中的表达量明显高于癌旁组织。

图1 RPS15a基因在癌组织及相应癌旁组织中的表达情况（C：胃癌组织；N：癌旁正常组织）

2.2 RPS15a的RNAi情况 RNAi后细胞中出现了明显的绿色荧光（见图2），提示此转染方式是可行的。对转染细胞的RPS15a的检测结果表明，直接以RNA进行扩增，未扩增出条带（见图3），表明本实验提取的RNA未受到质粒DNA的污染，可以进行表达的比较。BGC823-WT组、siNC组、siRPS15a-1组、siRPS15a-2组RPS15a RNA表达相对灰度比值分别为（0.71±0.11）、（0.69±0.09）、（0.37±0.05）、（0.20±0.06）；siRPS15a-1组、siRPS15a-2组RNA表达相对灰度比值与BGC-WT组、siNC组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），BGC-WT组与siNC组的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。BGC-WT组、siNC组、siRPS15a-1组、siRPS15a-2组RPS15a蛋白表达检测情况见图4，相对灰度比值分别为（4.11±0.15）、（3.99±0.23）、（2.31±0.35）、（2.13±0.21）；siRPS15a-1组、siRPS15a-2组蛋白表达相对灰度值与对照组的比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），BGC-WT组与siNC组的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 RT-PCR检测BGC细胞RPS15a干扰效果。BGC-WT：BGC细胞未经转染；siNC：BGC细胞转染非编码序列，作为阴性对照；siRPS15a-1、-2分别为BGC细胞RPS15a 1号和2号RNA干扰质粒；RT（-）：BGC-WTRNA未经逆转录。

2.3 RPS15a RNAi后对细胞生长的影响 Brdu染色结果显示，细胞增殖速度显著下降（图5）。同时细胞周期的状态分析表明，干扰后多数细胞集中在G0/G1期，也说明了细胞生长受到了抑制（图6）。在此基础上，细胞干扰后进行了克隆形成的比较实验。转染的细胞在软琼胶的平板上生长后，对细胞进行染色，结果发现，干扰后的细胞生长慢，克隆形成较少，克隆团也较小，而正常细胞和随机小片段的对照组细胞生长较好，克隆形成多，并且克隆团较大（图7）。

图4 Western blot检测RPS15a的表达（标注与图3相同）

图5 Brdu检测BGC细胞转染RPS15a干扰质粒48h后增值。BGC-WT：BGC细胞未经转染；siNC：BGC细胞转染非编码序列，作为阴性对照；siRPS15-1、-2分别为BGC细胞转染RPS15a 1号和2号RNA干扰质粒。*P＜0.05，siRPS15-1、-2分别为BGC-WT和siNC比较

图6 BGC细胞转染RPS15a干扰质粒48h后周期分布比较。BGC-WT：BGC细胞未经转染；siNC：BGC细胞转染非编码序列，作为阴性对照；siRPS15-1、-2分别为BGC细胞转染RPS15a 1号和2号RNA干扰质粒

3 讨论

RNAi是多种生物体内由双链RNA介导的同源mRNA降解现象，其本质是siRNA与靶向mRNA特异结合、并由RISC介导其降解，从而阻止mRNA的翻译，导致基因沉默，具有高效性、高特异性和毒性小的特点。随着siRNA在活体中的稳定性和转染效率的提高以及非特异性作用的减少，其在临床上正迅速得到广泛应用。

图7 BGC细胞转染RPS15a干扰质粒2周后克隆形成能力比较。BGC-WT：BGC细胞未经转染；siNC：BGC细胞转染非编码序列，作为阴性对照；siRPS15-1、-2分别为BGC细胞转染RPS15a 1号和2号RNA干扰质粒

RPS15a是高保守的核糖体蛋白，其基因位于16p13，全长为7 369bp，阅读框架编码130个氨基酸，相对分子量14 300。近来有学者在研究肝癌时发现，RPS15a表达可被HBvX蛋白上调，而上调RPS15a可加速人肝癌细胞株HepG2的生长及其在裸鼠体内的成瘤能力，提示该基因参与了肝癌的发生、发展[1]。Amsterdam已证实RPS15a是斑马鱼的癌基因。XU等[2]研究发现，下调RPS15a表达可抑制人类体外肝癌细胞的生长，推测该基因可能在肝癌的发生、发展中起到突出作用。Coleman等[3]在采用雌二醇治疗非雄激素依赖型前列腺癌的过程中发现，RPS15a表达下调。孟存英等[4]利用免疫组化方法研究发现，RPS15a在胃腺癌中表达高于癌旁组织，且随着胃癌浸润深度的增加，该基因阳性表达率也逐渐增高，提示RPS15a高表达与胃癌肿瘤细胞的侵袭和转移能力有关。Shen等[5]发现，RPS15a可与钙调素（CaM）结合，从而发挥其核糖体装配和翻译过程。CaM可能通过与Ca2+的结合，在肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移调控中发挥重要作用。

本研究发现，RPS15a在肿瘤组织中高表达，进一步证实该基因可能在细胞增殖中起重要作用。运用荧光定量PCR技术进一步验证发现，RPS15a在胃癌组织中表达显著高于其所对应的癌旁组织，这与既往研究结果是一致的，但其上调原因及在肿瘤形成中的地位目前尚不清楚。有学者认为RPS15a高表达可能与真核起始因子4F相互作用，导致细胞恶性转化，从而可能在蛋白翻译水平上介导肿瘤发生[6]。也有学者认为p53突变涉及核糖体的活性或调节功能，这也可能是RPS15a在胃癌中高表达的机制之一。

为进一步研究RPS15a基因在胃癌发生、发展中的作用，笔者针对该基因mRNA设计合成2对siRNA分子（RPS15a-1 siRNA，RPS15a-2 siRNA），转染胃癌BGC细胞，通过RT-PCR及Western blot结果显示，siRNA转染后可显著抑制RPS15a mRNA及蛋白的表达，证实了应用RNA干扰技术抑制RPS15a表达的可行性；应用Brdu检测48h后BGC细胞增殖情况发现，转染了siRNA的细胞较未转染及阴性对照细胞降低，而未转染细胞与阴性对照细胞相比无明显差异，这说明通过RNA干扰能有效的抑制BGC细胞增殖，可见RPS15a-1 siRNA及RPS15a-2 siRNA确实能阻断RPS15a的表达，抑制BGC细胞增殖，一方面提示RPS15a与胃癌癌的发生、发展、治疗及预后有密切的关系；另一方面提示RNA干扰可用于特异性阻断RPS15a表达，为靶向诱导胃癌细胞凋亡治疗提供了实验依据，为胃癌的基因治疗提供了理论基础。

本文结果还显示，siRPS15a作用于胃癌BGC细胞48h后G0/G1期细胞明显增多。肿瘤既是一类基因性疾病，也是细胞周期性疾病，几乎所有的癌基因疾病都要涉及细胞周期机制。细胞周期有3个调控点，分别调控G0/G1、G1/S、G2/M。其中G0/G1、G1/S调控点是控制细胞周期的开始，是控制肿瘤细胞周期基因治疗策略的重点，而G1-S转换是细胞周期最重要的调控点，G1期阻滞是细胞增殖抑制的重要环节，细胞不能进入S期，DNA合成无法完成，干扰了蛋白质代谢，从而抑制了肿瘤细胞的分裂。这说明RPS15a作用BGC细胞后使细胞阻滞于G0/G1期，不能进入S期，从而使细胞增殖抑制，促使细胞停止分裂。笔者认为，RPS15a可能是通过影响胃癌细胞周期，促进细胞增殖，这与XU等[2]的研究结果也是一致的。在此基础上，作细胞干扰后进行了平皿克隆形成的比较实验，结果发现干扰后的细胞生长慢，克隆形成较少，克隆团也较小，而正常细胞和随机小片段的阴性对照细胞生长较好，克隆形成多，并且克隆团较大。这些结果也同样表明siRNA可明显抑制BGC细胞生长和繁殖。

综上所述，运用RNAi技术干扰RPS15a基因不仅可以下调胃癌BGC细胞其表达，而且还可以抑制胃癌BGC细胞的生长增殖活性。RPS15a基因是否能够作为一个关键点从而被用于肿瘤的分子靶向治疗，还有待于基础和临床的进一步研究。同时，该基因的下调是否会影响正常细胞的功能，也有待于进一步分析。

[1]Lian Z,Liu J,Li L,et al．Human S15a expression is upregulatedby hepatitis B virus X protein[J]．Mol Carcinog,2004,40(1)：34-46．

[2]Xu M,Wang Y,Chen L,et al．Down-regulation of ribosomal protein S15A mRNA with a short hairpin RNA inhibits human hepatic cancer cell growth in vitro[J]．Gene,2014,536(1)：84-9．

[3]Coleman I M,Kiefery J A,Browny L G,et al．Inhibition of androgen-independent prostate cancer by estrogenic compounds is associated with increased expression of immune-related genes [J]．Neoplasia,2006,8(10)：862-878．

[4] 孟存英,袁东红,王映梅,等．人核糖体蛋白S15a在胃腺癌中的表达[J]．细胞与分子免疫学杂志,2007,23(10)：937-939．

[5]Shen X,Valencia CA,SzostakJ W,et al．Scanning the human proteome for calmodulin-binding proteins[J]．PNAS,2005,102(17)：5969-5974．

[6]Davide R,Pier P P．Dose the ribosom translate cancer[J]?Cancer, 2003,3(3)：179-192．

Knock-down of RPS15a by siRNA inhibits proliferation of gastric cancer BGC823 cells

Objective To investigate the effects of ribosomal protein S15a (RPS15a)in proliferation of gastric cancer cell BGC823 by RNA interference technique．MethodsBGC823 cells were transfected with random non-coding sequences(siNC group),siRPS15a-1(siRPS15a-1 group)or siRPS15a-2(siRPS15a-2 group),respectively．RPS15a RNA and protein expression was detected by RT-PCR and Western Blot test,respectively;and the cell proliferation was determined by flow cytometry．ResultsThe expression levels of RPS15 in SiRPS15a-1 and siRPS15a-2 groups were significantly lower than those in non-transfected BGC823 cells (WT group)and siNC group (all P＜0．05);no significant differences was found between WT and siNC groups (P＞0．05)．Cell proliferation rate were decreased significantly in SiRPS15a-1 and siRPS15a-2 groups,and most cells were in G0/G1 phase．ConclusionRPS15a RNA interference technique inhibits cells growth,which is associated with the knock-down of RPS15a expression in BGC823 cells．

Ribosomal protein S15a(RPS15a)Gastric cancer(GC)RNA interference(RNAi)