回旋沉淀时间对啤酒生产中麦汁老化程度的影响

吕慧威，胡雪莲，蔡 勇

（1.吉林师范大学博达学院，吉林 四平 136000；2.四平金士百纯生啤酒有限公司，吉林 四平 136001）

随着消费水平的提高，消费者的满足度已经不仅停留在啤酒带来的口感和视觉享受，啤酒的生产安全性、产品的质量稳定性越来越得到关注。啤酒的货架期是由其生物稳定性、非生物稳定性和风味稳定性决定的[1]，随着研究的深入，前两项已不再是引起啤酒质量问题的主要原因，科研工作者已把研究重点转移到啤酒风味和口感变化的主要影响因素，人们也正在积极探索导致啤酒风味老化的主要原因及防范措施。啤酒老化可以延缓，但不可以杜绝，重点是通过调控生产出风味稳定性高的啤酒，从而延长啤酒保鲜[2]。为了提高啤酒的抗老化性能，一方面尽可能多地保留一些还原性物质到啤酒中去；另一方面要尽可能少的产生老化风味的前驱物质[3]。

糖化是制造啤酒的重要环节之一，为了提高原料利用率并保证啤酒质量，糖化过程需要较长时间地借助于热的作用，在较高温度条件下麦汁中的成分会发生氧化等反应[4]，因此糖化过程不仅是麦汁产生的过程，也是啤酒风味老化物质及其前躯体大量生成的阶段[5]，高的热负荷意味着啤酒老化的前驱体物质数量增多，会给麦汁和啤酒带来焦糊口味，不利于啤酒的口味稳定性[6]，减少热负荷，有利于降低麦汁的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值及老化物的生成[7]。麦汁各阶段热负荷的增加值主要由温度和在该温度条件下的停留时间所决定[8]。由于回旋槽中温度相对较高，而挥发性弱，分析可能会造成醛的积累，因而麦汁在回旋槽的停留时间对老化羰基化合物的影响值得深入思考[2]。前期有关学者已就煮沸阶段热负荷对啤酒老化的影响进行了深入研究，但回旋沉淀阶段的影响鲜为报道，值得深入研究。反-2壬烯醛（trans-2-nonenal，T2N）的前驱物就是在糖化过程中产生的，它是由麦芽中的脂肪酸在酶的作用下形成的，也被视为是原料新鲜度的指示剂[9]，要降低成品啤酒中的T2N，最重要的是减少糖化过程中T2N及其前驱物的产生[10]。本研究以TBA值、T2N及其前驱物等为指标，评价了回旋沉淀阶段热负荷对麦汁老化的影响，并对固相微萃取气质法联用（solid phase extraction-chromatograph-mass spectrometry，SPME-GC/MS）法检测麦汁中反-2壬烯醛（T2N）前驱体的方法进行了优化，以期为啤酒生产中糖化阶段热负荷的控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验麦汁、发酵液及啤酒：四平金士百纯生啤酒有限公司。

反-2-壬烯醛标准品（色谱纯）：美国Sigma公司；无水乙醇（色谱纯）、磷酸（分析纯）、NaCl（分析纯）：天津市滨海科迪化学试剂有限公司；高纯二氧化碳（纯度≥99.5%）：企业自产。

1.2 仪器与设备

配有75 μm CAR-PDMS萃取头的SPME装置：德国SIGMA-aldrich公司；Clarus600 GC/MS气相色谱-质谱联用仪（配有电子电离源）：美国PE公司；UGC-12MF氮吹仪：北京优晟联合科技有限公司；FE20型pH计：瑞士Mettler Toledo集团公司；UV1800型分光光度计：日本岛津公司、Vos Rot 90/25型自动浊度仪：荷兰HAFFMANS公司。

1.3 方法

1.3.1 T2N前驱体检测的样品前处理方法[11-12]

将氮吹仪通入高纯二氧化碳，用移液管准确移取5 mL待测样品于22 mL顶空瓶中，加入3 g NaCl，并用二氧化碳吹走瓶中的空气，2 min后迅速压盖密封，沸水浴中煮沸120 min，再置于50 ℃恒温水浴中用75 μm CAR/PDMS萃取头萃取90 min，待检测。

1.3.2 仪器分析条件

（1）色谱条件

色谱柱：HP-5MS毛细管色谱柱（40 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气：氦气（纯度≥99.999%）；流速：1 mL/min；升温程序：柱温箱起始温度60 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，保持7 min，以10 ℃/min升至290 ℃，保持5 min；进样口温度：280 ℃；分流方式：不分流；进样量：1 μL。

（2）质谱条件

电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源，电离电压70 eV，离子源温度250 ℃，传输线温度250 ℃，测定模式为选择离子监测（selected ion monitoring，SIR），溶剂延迟3 min，全扫描质核比范围29～300 u。

1.3.3 检测方法

（1）麦汁透光率的检测方法

用离心试管量取50 mL麦汁，充分混合均匀后在波长530 nm条件下检测其吸光度值。

（2）麦汁浊度的检测方法

（3）T2N前驱体的检测方法

采用SPME-GC/MS方法测定样品中的T2N前躯体含量。用保留时间和离子碎片比例定性，用外标法定量，用峰面积计算。标准工作液和待测样液中的T2N前躯体含量值均应在仪器检测的线性范围内，其质量浓度与响应值有良好的线性关系，相关系数R为0.991～0.998 范围内。

（4）麦汁TBA值的检测方法[13-14]

参照参考文献[13-14]中的分光光度计法，测定麦汁TBA值。

（5）麦汁中9种典型老化物质的检测方法[15]

参照参考文献[15]中的气相色谱质谱法（GC/MS），测定麦汁中9种典型老化物质（糠醛、2-乙酰基呋喃、苯甲醛、5-甲基糠醛、苯乙醛、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、烟酸乙酯、γ-壬内酯）。

2 结果与分析

2.1 麦汁T2N前躯体检测方法的优化

2.1.1 T2N前躯体的定性定量分析

任何事物与其他事物之间的矛盾，是事物发展的外部原因。传统体育各有不同的形式存在，但又有共通相似之处；正因为这些异同，造成了神圣形式上的博弈：

定性分析：用乙醇作溶剂，配制100 μg/mL T2N标准样品，直接自动进样分析，初步确定该物质的保留时间为15.98 min，查看离子碎片发现各碎片符合该物质在谱库里的比例。

选择定量碎片：从NIST质谱数据库中搜索T2N的特征离子碎片，含量较高的有41、70、122和140，含量最高的是41，但因为这个碎片质量数太低，而且大部分化合物都会有，不具有典型性，扫描后会有大量其他碎片干扰，出现的峰不是目标峰，影响对结果的判断。而其他三个碎片质量数相对较高，扫描后匹配度较高。图1为提取41、70、122和140离子碎片的色谱图，峰值高度代表其响应值强度。由图1可知，70碎片响应值最高。最终确定选择70、122和140为标样的定性离子碎片，选择70为定量离子碎片。

图1 不同选择离子碎片下的T2N色谱图Fig.1 T2N chromatogram of different fragments under the selected ion

验证目标峰：取10 mL麦汁处理后进样分析，可以检测到目标峰。为进一步验证，在麦汁中加入一定量标样，按照麦汁处理的方法萃取后再次检测，发现原有的目标峰峰面积有所增加，说明15.98 min出现的峰就是所要检测的目标峰。

2.1.2 标准曲线的绘制

麦汁经高温煮沸后的反-2-壬烯醛（T2N）含量可达200 μg/L，依据此数据设计了在麦汁中添加标准品0、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L和400 μg/L，按照样品的前处理过程操作并用气质联用仪（GC/MS）检测其峰面积，结果扣除空白，分别以各自的峰面积（y）对质量浓度（x）进行回归计算，得到回归方程见表1。

表1 两根萃取头T2N的标准工作曲线Table 1 The T2N standard working curve of two extraction fibers

从表1可以看出，两根萃取头的检测结果均具有良好的线性关系，R2均＞0.990，认为可以用作结果的定量分析。

2.1.3 方法重复性和再现性的验证

表2 两根萃取头T2N的重复性和再现性结果Table 2 The T2N repeatability and reproducibility of two extraction fibers

经过之前一系列方法优化后，检测结果较稳定。如表2所示，从第2天的连续5针结果可以看出，A萃取头的单天重复性相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.67%，连续3 d的再现性为2.22%，远远低于重复性＜10%，再现性＜15%的要求；B萃取头较A萃取头的结果稍高一些，但也符合要求，说明该方法的结果重现性和再现性符合检测要求。

2.1.4 加标回收率的测定

表3 两根萃取头T2N的加标回收率结果Table 3 Adding standard recovery rate of two extraction fibers

在麦汁中分别加入40 μg/L和80 μg/L标样，按照样品的前处理方法煮沸、萃取、分析，扣除空白后计算含量，结果见表3。由表3可知，两个萃取头的两个不同质量浓度加标的回收率都在90%～105%，满足回收率80%～120%的检测要求。

结果表明，经优化的T2N检测方法可以作为麦汁老化物质反-2-壬烯醛含量的一种可靠的评价手段。

2.2 回旋沉淀时间对麦汁老化程度的影响

为了验证回旋沉淀时间对麦汁老化物质的影响，设计试验将回旋沉淀时间由原来的30 min缩短为25 min和20 min，以T2N和TBA值为指标评价其差异。试验之前先要以透光率和浊度为指标对麦汁的澄清效果进行评价。

2.2.1 麦汁不同冷却时间透光率和浊度的差异

为验证回旋沉淀时间对麦汁老化程度的影响，需要取样进行T2N和TBA的检测，但选取哪个冷却时间的样品更具有代表性尚不明显，一锅麦汁冷却过程从开始至完毕大约需要60 min左右的时间，在这区间选择哪个时间取样最合适，是不是每批样品都有这个趋势尚不明确，因此，本轮试验分别取冷却开始、冷却30 min和冷却60 min三个时间段的麦汁，检测透光率和浊度，比较其差异。

图2 麦汁不同冷却时间对透光率和浊度平均值的影响Fig.2 Effect of different cooling time on average value of wort transmittance and turbidity

分别选取三个不同品种、不同生产时间的麦汁样品进行检测，比较其差异。从图2可以看出，随着冷却时间的延长，麦汁的浊度平均值逐渐降低，透光率的平均值逐渐升高，说明冷却后期麦汁的澄清效果最好，而且三个品种麦汁的变化趋势完全一致。从图3可以看出，随着冷却时间的延长，麦汁的浊度和透光率多次检测结果的RSD都呈逐渐减小的趋势，由于品种不同，减小的幅度有所差异，但趋势是一致的，说明到冷却的后期不但澄清度高了，而且系统更稳定，检测的结果更稳定。因此，选择在冷却60 min时取麦汁样品进行分析更具有代表性。

图3 麦汁不同冷却时间对透光率和浊度RSD的影响Fig.3 Effect of different cooling time on RSD of wort transmittance and turbidity

2.2.2 麦汁不同回旋沉淀时间透光率和浊度的差异

本试验选取了进入同一个发酵罐的4锅麦汁中的后3锅作为试验对象，保证除了试验因素的不同外，其他条件，包括原辅料、添加剂、生产设备都是同一批。

表4 不同回旋沉淀时间对麦汁透光率和浊度的影响Table 4 Effect of different whirlpool time on wort transmittance and turbidity

3批平行试验的透光率和浊度见表4。比较9批麦汁的结果发现，随着回旋沉淀时间的缩短，透光率都有所降低，而浊度呈上升趋势，只是变化的幅度有所不同。其中，将回旋沉淀时间由原来的30 min缩短至25 min时，透光率和浊度有轻微变化，透光率增加了2.64%，浊度增加了2.13%，变化幅度非常小；而将回旋沉淀时间缩短至20 min时，二者都有较明显变化，其中，透光率较30 min增加了16.74%，浊度增加了15.65%。结果表明，将回旋沉淀时间缩短5 min对麦汁的浊度影响不大，但缩短10 min将会明显影响麦汁的澄清效果，这样将会对后期的过滤等环节产生很大影响。

2.2.3 麦汁不同回旋沉淀时间T2N和TBA的差异

表5 不同回旋沉淀时间T2N和TBA比较Table 5 The T2N and TBA in different whirlpool time

3批平行试验的T2N和TBA见表5。比较9批麦汁的结果发现，将回旋沉淀时间由30 min缩短至25 min时，T2N的含量降低了12.39%，较之前明显降低，TBA也由0.334降至0.314，降低了5.99%；而从25 min缩短至20 min时，二者的含量也在呈下降趋势，但幅度没有那么明显，T2N和TBA分别降低了1.00%和2.87%。从上述结果可以看出，当回旋沉淀时间过长，尤其是＞25 min时，大大增加了反应体系的热负荷，导致多种老化物质，尤其是醛类物质的生成。因此，适当降低沉淀静止时间，可有效降低老化物质及其前躯体的含量，但时间过短，沉淀效果不好又对麦汁的清亮度产生较大影响。因此，将回旋沉淀时间缩短至25 min既可减少老化物质的生成，还能保证麦汁的澄清质量。

2.2.4 麦汁不同回旋沉淀时间9种典型老化物质的差异

图4 麦汁不同回旋沉淀时间9种典型老化物质含量比较Fig.4 The content of 9 kinds of typical aging substance in wort with different whirlpool time

由图4可知，在检测的9种典型老化物质中，随着回旋沉淀时间的缩短，糠醛的含量有明显的降低，而其他8种物质没有明显的变化，说明糠醛受热负荷影响最大，在温度一定的条件下，时间越短，热负荷越小，分析其原因为，糠醛是美拉德反应的产物，该反应受热负荷影响较大，这也是糠醛常常被作为热负荷指示剂的原因，因此，将回旋沉淀时间缩短至25 min，是在保证麦汁澄清质量的基础上，大大降低老化物质含量较有效的方法。

3 结论

随着回旋沉淀时间的缩短，透光率都有所降低，而浊度呈上升趋势，将回旋沉淀时间缩短5 min对麦汁的浊度影响不大，但缩短10 min将会明显影响麦汁的澄清效果。

将回旋沉淀时间由30 min缩短至25 min和25 min缩短至20 min时，T2N、TBA和糠醛的含量都有所降低，但缩短5 min的幅度＞10 min，因此，适当降低沉淀静止时间，可有效降低老化物质及其前躯体的含量。

结果表明，将回旋沉淀时间缩短至25 min，在保证麦汁澄清质量的基础上可明显降低老化物质含量，大大提高啤酒的抗老化能力。降低回旋沉淀时间可有效降低麦汁热负荷，减少老化物质及其前驱体的生成，降低了潜在隐患，是提高啤酒抗老化能力的有效途径之一。

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