不同染色方法检测HBsAg阳性患者肾组织中乙肝抗原的效果比较

2014-04-12汤绚丽孙琳朱晓玲胡云琴闵曼

浙江医学 2014年1期

汤绚丽孙琳朱晓玲胡云琴闵曼

汤绚丽孙琳朱晓玲胡云琴闵曼

目的探讨不同染色方法检测HBsAg阳性患者肾组织中乙肝抗原的效果。方法收集血清HBsAg阳性的肾穿刺患者77例，分别采用免疫荧光法和改良免疫组化法检测肾组织HBsAg及HBcAg阳性表达情况。结果继发于乙肝病毒感染相关的肾小球肾炎（HBV-GN）中，HBsAg免疫荧光法及改良免疫组化法敏感性为48．1%及100%；HBcAg免疫荧光法及改良免疫组化法敏感性为22．2%及70．4%，差异均有统计学意义（均P＜0．01）。非乙肝相关性肾小球肾炎（NHBV-GN）中，HBsAg免疫荧光法及改良免疫组化法特异性为98%及96%；HBcAg免疫荧光法及改良免疫组化法特异性为100%及96%，两种方法特异性均较高，差异均无统计学意义（均P＞0．05）。乙肝抗原血症者肾组织HBsAg及HBcAg改良免疫组化法平均阳性强度明显高于免疫荧光法（P＜0．01）。血清乙肝“大三阳”、DNA复制者HBsAg改良免疫组化法检测阳性强度均明显高于“小三阳”及DNA不复制者（P＜0．05或0．01）。结论改良免疫组化染色法提高了乙肝抗原血症者肾组织乙肝抗原的检出率及肾小球疾病尤其是HBV-GN诊断的准确性，同时HBsAg阳性强度还可预测乙肝感染严重程度。

乙肝抗原血症乙肝相关性肾小球肾炎免疫荧光法改良免疫组化法

乙肝抗原血症患者肾小球疾病发生率高，按其发病机制分为原发性肾小球肾炎即非乙肝相关性肾小球肾炎（non-hepatitis B virus associated glomerular nephritis，NHBV-GN）和继发于乙肝病毒感染相关的肾小球肾炎（hepatitis B virus associated glomerular nephritis，HBVGN）。自Combes等[1]1971年首次报道乙肝病毒感染引起肾病以来，乙型肝炎病毒相关性肾炎已成为我国常见的继发性肾病之一。HBV抗原检测方法有免疫组化法、免疫荧光法、原位分子杂交或原位聚合酶链反应等技术。由于使用方法、试剂来源的不同，各实验室检测结果差异较大，直接影响HBV-GN诊断的准确性。免疫组化法和免疫荧光法为临床较容易开展的检测方法，免疫荧光法敏感性强，特异性差，而免疫组化法特异性强，敏感性差[2]。但在临床上染色效果究竟如何尚待讨论。本研究应用改良免疫组化法检测，并与免疫荧光法相比较，探讨两种技术的临床应用价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料收集我院2010-01—2013-06血清HB-sAg阳性的肾穿刺患者77例，包括乙肝携带（仅HBsAg阳性）2例，“小三阳”（HBsAg、抗HBe、抗HBc均阳性）51例，“大三阳”（HBsAg、HBeAg均阳性、抗HBc或抗HBe阳性）24例。其中男51例，女26例；年龄20～74岁，平均（42±15）岁。临床表现以慢性肾小球肾炎（38例）及肾病综合征（24例）为主。常规免疫荧光、HE及特殊染色诊断病理类型。乙肝相关性肾小球疾病诊断标准参照1990年会议纪要[3]：（1）血清HBV抗原阳性；（2）肾组织活检证实有肾小球肾炎，并除外狼疮性肾炎等继发性肾小球疾病；（3）肾组织切片中找到HBV或抗原。病理类型中，HBV-GN 27例，占35.1%，其中最常见的为乙肝相关性膜性肾病（12例），其次为乙肝相关性IgA肾病（11例）。NHBV-GN以IgA肾病（35例）为主，其次为系膜增生性肾小球肾炎（14例）。

1.2 肾组织HBV抗原的检测

1.2.1 免疫荧光法检测采用间接免疫荧光法，一抗为鼠抗人HBsAg抗体及兔抗人HBcAg抗体（购自DAKO公司）、二抗为羊抗鼠IgG/FITC及羊抗兔IgG/FITC（购自DAKO公司）。新鲜肾组织5μm厚冰冻切片，95%冷丙酮固定10min，加适当稀释度的一抗，37℃湿盒孵育40min。PBS洗后分别滴加相应的荧光二抗，37℃湿盒孵育30min，荧光显微镜下镜检。阳性积分按强度及部位判断：以阳性最强的肾小球为准，节段（＜50%血管袢受累，分布于系膜区或基底膜）阳性：0.5；弥漫（＞50%血管袢受累，分布于系膜区或基底膜）黄绿色可见：1；弥漫黄绿色：2；弥漫黄绿色刺眼：3。

1.2.2 改良免疫组化法检测采用EliVision二步法：一抗与免疫荧光法相同。二抗采用EliVision Plus免疫组化广谱试剂盒（福州迈新公司）。石蜡包埋组织3μm厚切片，脱蜡至水，柠檬酸盐抗原修复液微波修复，自然冷却后，用3%H2O2除去内源性过氧化物酶。胰蛋白酶37℃修复15min。山羊血清封闭20min后加一抗，37℃湿盒孵育1.5h。增强剂37℃孵育30min后使用通用型二抗37℃孵育30 min。DAB显色，苏木素复染，封片。阳性积分按强度及部位判断：以阳性最强的肾小球为准，节段阳性：0.5；弥漫棕黄色：1；弥漫棕褐色：2。

1.3 统计学处理采用SPSS13.0统计软件。HBsAg及 HBcAg两种方法检测的阳性强度符合正态分布，用表示，采用t检验；DNA复制与否，大、小三阳组间HB-sAg及HBcAg两种方法检测的阳性强度为非正态分布资料，用中位数表示，采用Mann-whitney U检验；两种方法敏感性及特异性分析以百分率表示，采用χ2检验；免疫荧光法检测两指标阴阳性在大、小三阳组及DNA复制与否组间分布差异采用Fisher精确概率法。

2 结果

2.1 肾组织HBsAg及HBcAg定性检测情况肾组织HBsAg及HBcAg免疫荧光染色呈黄绿色，改良免疫组化染色呈黄褐色，主要分布于系膜区、上皮下、基底膜内。HBV-GN中，HBsAg、HBcAg指标用免疫荧光法检测，均阳性者5例，而改良免疫组化法为19例，差异有统计学意义（P＜0.01）。其中HBsAg免疫荧光法敏感性为48.1%，改良免疫组化法为100%；HBcAg免疫荧光法敏感性为22.2%，而改良免疫组化法为70.4%，差异均有统计学意义（均P＜0.01），说明无论是两指标同时检测还是单一指标检测，改良免疫组化法敏感性远高于免疫荧光法。NHBV-GN中HBsAg、HBcAg指标用免疫荧光法检测，均阴性者49例，改良免疫组化法为47例，差异无统计学意义（P＞0.05）。其中单一指标HBsAg免疫荧光法及改良免疫组化法特异性为98%及96%；HBcAg免疫荧光法及改良免疫组化法特异性为100%及96%，差异均无统计学意义（均P＞0.05），详见图1和表1、2。

2.2 肾组织HBsAg及HBcAg半定量检测情况乙肝抗原血症者肾组织HBsAg免疫荧光法及改良免疫组化法平均阳性强度为0.15±0.28及0.74±0.89；HBcAg免疫荧光法及改良免疫组化法平均阳性强度为0.04±0.14及0.22±0.36，改良免疫组化法阳性强度明显高于免疫荧光法，差异均有统计学意义（均P＜0.01），详见图2。

2.3 血清乙肝不同感染程度患者肾乙肝抗原两种检测方法定量比较血清乙肝“大三阳”及DNA复制者HB-sAg改良免疫组化法检测阳性强度明显高于“小三阳”及DNA不复制者（P＜0.05或0.01）；而免疫荧光法检测两种抗原在大三阳、小三阳组及DNA复制与否组间差异均无统计学意义（P＜0.05），详见表3、4。

图1 HBV-GN两种染色方法（A：HBV-IgAN HBsAg免疫荧光法，×200；B：HBV-IgAN HBcAg免疫荧光法，×200；C：HBV-IgAN HB-sAg改良免疫组化法，×200；D：HBV-IgAN HBcAg改良免疫组化法，×200；E：HBV-MN HBsAg免疫荧光法，×200；F：HBV-MN HBcAg免疫荧光法，×200；G：HBV-MN HBsAg改良免疫组化法，×200；H：HBV-MN HBcAg改良免疫组化法，×200）

表1 HBV-GN肾乙肝抗原检测两种实验方法的敏感性比较

表2 NHBV-GN肾乙肝抗原检测两种实验方法的特异性比较

图2 乙肝抗原血症者肾组织乙肝抗原两种检测方法阳性强度比较（与免疫荧光法比较，**P＜0.01）

3 讨论

以往报道成人HBV-GN患者临床表现多样，最多见为肾病综合征，也可表现为肾小球肾炎，肉眼或镜下血尿、无症状性蛋白尿等；病理类型常见于膜性肾病和IgA肾病系膜增生性肾炎[4-5]。本研究结果与以往基本一致。

表3 血清乙肝不同感染程度患者肾乙肝抗原两种检测方法定量比较

表4 血清乙肝不同感染程度组肾乙肝抗原两种检测方法定量比较

免疫荧光技术以稳定可靠，敏感性高的优点在肾组织中的应用已有半世纪的历史，为公认的较好观察方法，但乙肝检测应用间接免疫荧光法，其稳定性和敏感性尚无定论。本研究发现该技术检测HBsAg及HBcAg标记时敏感性均较差，特异性尚可，可能是由于二抗并未连接任何放大系统，导致检测敏感性大大降低。

传统免疫组化法检测肾组织乙肝抗原时，常因为背景色重而难以判别阳性真伪，导致误诊率高。陈立章等[6]用传统的免疫组化法检测HBV-GN患者肾组织HbsAg及HbcAg阳性率仅为76.2%及42.9%，而NHBV-GN患者两指标阳性率也有75%，说明传统免疫组化方法敏感性低且特异性差。本研究采用改良两步法免疫组化染色技术，采用高温柠檬酸盐配合胰蛋白酶消化的两步抗原修复方法,使抗原充分暴露；并用增强剂增加细胞通透性，加强一抗与抗原的紧密结合；继而二抗连接多聚体信号放大系统，使整体敏感性大大提升。多聚物中无链霉菌抗生物素蛋白，不会与组织中生物素结合而造成非特异性着色或背景染色，提高了检测方法的特异性。已有学者用该方法对HBV-GN进行研究，发现乙肝抗原检测阳性率大大提高[7-8]。我们观察切片后发现改良免疫组化法染色尤其是HBsAg阳性定位好，强度可，背景较干净，诊断准确性高；且不论是两指标同时检测还是单一指标检测，其敏感性远高于免疫荧光法，而特异性差别不大；从阳性强度上看，改良免疫组化法也明显高于免疫荧光法。同时，两指标改良免疫组化法的阳性强度与乙肝感染严重程度存在一定相关性，与蒋伟等[9]报道类似，可作为预测患者乙肝感染严重程度的指标。因此，该方法是检测肾组织乙肝抗原的首选。

总之，改良免疫组化染色法提高了乙肝抗原血症者肾组织乙肝抗原的检出率及肾小球疾病，尤其是HBVGN诊断的准确性，两指标阳性强度还可预测乙肝感染的严重程度，明显优于免疫荧光法，具有较高的临床应用价值。

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[4]Bhimma R,Coovadia H M．Hepatitis B virus-associated nephropathy[J]．Am J Nephrol,2004,24(2)：198-211．

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Comparison of immunofluorescent staining with immunohistochemistry in detection of HBsAg and HBcAg in renal biopsy specimens

ObjectiveTo compare two immunochemical methods in detection of HBsAg and HBcAg in renal biopsy specimens．MethodsRenal biopsy samples were taken from 77 HBsAg positive patients with nephritis．HBsAg and HBcAg in renal tissue were detected by indirect immunofluorescent staining(IIFS)and improved immunohistochemical staining(IIHS),respectively．ResultsIn patients with hepatitis B virus-related glomerular nephritis(HBV-GN)the sensitivity of HBsAg detected by IIHS and IIFS was 100．0%and 48．1%,respectively(P＜0．01);that of HBcAg was70．4%and 22．2%,respectively(P＜0．01)．In non-HBV-GN patients,the specificity of HBsAg detected by IIFS and IIHS was 98．0%and 96．0%respectively,while that of HBcAg was 100．0%and 96．0%(P＞0．05)．The intensity score of HBsAg was 0．15 by IIFS and 0．74 by IIHS,while that of HBcAg was 0．04 by IIFS and 0．22 by IIHS,respectively(both P＜0．01)．The intensity scores of HBsAg in patients with serum positive HB-sAg,HbeAg and positive HBV-DNA were significantly higher than those with positive HBsAg,HBeAb,HBcAb and negative HBV-DNA(P＜0．05 or 0．01)．ConclusionThe improved immunohistochemical staining method can increase the detection rate of renal HBAg in HBV-GN patients;and the intensity score of HBsAg is predictable for the severity of HBV infection．

HBV antigenemia HBV associated glomerulonephritis Indirect immunofluorescent staining Improved immunohistochemical staining