Girdin蛋白在乳腺癌组织中的表达及临床意义

2014-04-12丁耘峰平金良王晓红马志红

浙江医学 2014年1期

丁耘峰平金良王晓红马志红

丁耘峰平金良王晓红马志红

目的探讨Girdin蛋白在乳腺癌组织中的表达及其意义。方法采用免疫组化Envision二步法检测128例浸润性乳腺癌、38例导管内癌、30例单纯性导管上皮增生及30例正常乳腺组织中Girdin蛋白的表达情况，并分析其临床病理意义。结果Girdin蛋白在正常乳腺组织、单纯性导管上皮增生、导管内癌及浸润性乳腺癌中的阳性表达率分别为10．0%、23．3%、42．1%、51．6%，呈逐级上升趋势，差异有统计学意义（P＜0．05）。浸润性乳腺癌组织中Girdin蛋白的表达与TNM分期、淋巴结转移及人表皮生长因子受体2（HER-2）表达明显相关，并与患者的生存时间也明显相关（均P＜0．05）。结论Girdin蛋白在乳腺癌的发生、演变过程中起重要作用。其表达与患者的生存期密切相关，可作为预测乳腺癌预后的参考指标。

乳腺癌 Girdin蛋白免疫组化预后

1 资料和方法

1.1 临床资料收集本院2004-01—2006-12有完整临床病理资料的手术切除乳腺浸润性导管癌标本128例、导管内癌38例及单纯性导管上皮增生30例，另取30例正常乳腺组织（取自乳癌切除标本中距肿瘤3cm以外并经病理检查证实为正常组织）作为对照。128例浸润性导管癌参照2003年WHO乳腺癌分类及分级标准均为非特殊类型，组织学分级Ⅰ级26例，Ⅱ级56例，Ⅲ级46例；依照国际抗癌协会乳腺癌TNM分期标准，Ⅰ期32例，Ⅱ期64例，Ⅲ期32例；患者均为女性，年龄35～78岁，中位年龄46岁；每例平均解剖淋巴结15枚，76例发生淋巴结转移，转移率为59.4%；所有患者术前均未接受内分泌治疗或化疗。

1.2 试剂兔抗人Girdin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，CerbB-2单克隆抗体、EnVision二步法试剂盒购自丹麦Dako公司，4℃冰箱保存。

1.3 实验方法标本用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成4μm厚切片，经脱蜡、脱苯、水化，工作浓度Girdin为1∶800，CerbB-2为1∶200，免疫组化染色方法和步骤按EnVision二步法试剂盒说明书进行，用PBS代替一抗作为阴性对照，公司提供的阳性切片作为阳性对照。

1.4 结果判定标准 Girdin蛋白的判定标准：以胞质和（或）胞核出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色强度和染色细胞百分比进行评定和分析，其中无染色为0分，浅染色为1分，中等染色为2分，强染色为3分；无染色细胞为0分，染色细胞≤25%为1分，染色细胞占26%～50%为2分，染色细胞＞50%为3分。将每张切片的染色强度与染色细胞百分比得分相乘为其总得分，其中0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中度阳性（++），≥6分为强阳性（+++）。通过CerbB-2免疫组化结果反映人表皮生长因子受体2（HER-2）状况，评分标准参照乳腺癌HER-2检测指南（2009版），0～+为阴性，+++为阳性，++经荧光原位杂交检测验证。

1.5 统计学处理采用SPSS11.0统计软件，不同组织及临床特征者之间Girdin蛋白阳性表达率的比较及关系分析采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，用Log-rank检验判断差异性。

2 结果

2.1 不同乳腺组织Girdin蛋白表达的比较 Girdin蛋白表达位于胞质和（或）胞核，呈棕黄色颗粒，单纯性导管上皮增生和正常乳腺组织中Girdin蛋白阳性表达者均为+，导管内癌中阳性表达者以+为主，浸润性导管癌阳性表达者大多呈++～+++（图1-4）。不同乳腺组织Girdin蛋白表达阳性率的比较见表1。

图1 Girdin蛋白在正常乳腺组织中呈阴性表达（EnVision二步法，×100）

图2 Girdin蛋白在乳腺导管上皮增生中呈弱阳性表达（EnVision二步法，×200）

图3 Girdin蛋白在浸润性乳腺癌组织中呈阳性表达（EnVision二步法，×100）

图4 Girdin蛋白在浸润性乳腺癌组织中呈强阳性表达（EnVision二步法，×200）

表1 不同乳腺组织Girdin蛋白表达阳性率的比较

由表1可见，正常乳腺组织、良性导管增生、导管原位癌、浸润性乳腺癌Girdin蛋白阳性表达率呈逐级上调，浸润性乳腺癌与导管内癌、单纯性导管上皮增生及正常乳腺组织比较，差异均有统计学意义（χ2=8.279、15.226、18.763，P=0.041、0.002、0.000）。

2.2 浸润性乳腺癌不同临床特征者Girdin蛋白阳性表达率的比较见表2。

由表2可见，Girdin蛋白表达与乳腺癌患者TNM分期、淋巴结转移及HER-2表达相关（均P＜0.05），而与年龄、肿块大小及组织学分级无关（均P＞0.05）。

2.3 Girdin蛋白表达阳性与阴性者术后生存情况的比较术后随访60～96个月，绘出Girdin蛋白表达阳性与阴性患者的总生存曲线，显示Girdin蛋白的表达与患者预后有相关性（P=0.041）（图5）。

表2 浸润性乳腺癌不同临床特征者Girdin蛋白阳性表达率的比较

图5 Girdin蛋白表达阳性和阴性患者的总生存曲线

3 讨论

Girdin是一个由1 870个氨基酸残基构成的大分子蛋白质，又被命名为Akt磷酸化增强子（Akt-phosphorylation enhancer，APE），是一个新的肌动蛋白结合蛋白，通过免疫组化可检测其表达。实验证明Girdin是维持肌动蛋白结构所必需的物质[1-2]。肌动蛋白骨架的完整性和重组性是维持细胞形态和促使细胞运动所必须的，其骨架结构的重组被认为在肿瘤转移过程中发挥关键作用[4]，因此可以认为Girdin在肿瘤细胞转移、侵袭过程中起重要作用。

本研究结果显示，Girdin蛋白阳性表达率从正常乳腺组织、单纯性导管上皮增生到导管内癌、浸润性乳腺癌呈逐级上调，浸润性乳腺癌的阳性表达率与正常乳腺组织、单纯性导管上皮增生及导管内癌均有统计学差异。这一结果与Jiang等[5]的报道相仿，提示Girdin蛋白的高表达与乳腺癌发生、演进相关。

Girdin蛋白在促进肿瘤细胞侵袭、转移方面所起的作用可能通过以下机制：（1）参与细胞的移行及肿瘤的转移。肿瘤转移一直是恶性肿瘤治疗所面临的最大难题，约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移[6]。体外实验证明，Girdin蛋白参与调控细胞移行。剔除Girdin蛋白的多种细胞系，包括vero细胞、HeLa细胞、MDA-MB-231、HUVEC细胞等均现出细胞移行能力受损，肿瘤细胞体外侵袭能力下降[2]。Jiang等[5]发现，在乳腺癌动物模型中，剔除 Girdin可使肿瘤的肺转移能力明显下降。Garcia-Marcos等[7]发现，在人具有高转移能力的乳腺癌、结肠癌及胰腺癌组织中，Girdin蛋白的表达明显增强。进一步的研究发现，在Girdin蛋白高表达的结肠癌患者中，肿瘤发生转移的时间早，患者预后差。本结果也证实Girdin蛋白表达强度与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及HER-2表达有明显关系，提示Girdin蛋白表达可影响乳腺癌肿瘤生物学行为。（2）Girdin蛋白具有调节细胞增殖、凋亡以及影响细胞周期的作用。Ghosh等[8]发现，Girdin蛋白可以结合并激活Gi3，后者可进一步激活PI3K-Akt信号转导通路。鉴于PI3K-Akt信号转导通路在细胞生长过程中有重要作用，因此Girdin蛋白必然在这个过程中发挥作用。他们还发现，在含有GEF片段缺失的 Girdin蛋白异常剪切体的细胞中，正常的Girdin蛋白表达受抑制，生长因子刺激无法激活Gαi，转而激活有丝分裂相关的信号分子，从而影响诱导细胞有丝分裂的发生和细胞增殖[9]。Anai等[10]指出，在HepG2细胞株中剔除Girdin蛋白，则DNA的合成能力明显下降，并能使细胞活性及增殖能力明显下降，细胞凋亡明显增加，同时四倍体及多倍体细胞增多。（3）Girdin蛋白对肿瘤新生血管也有促进作用。肿瘤血管生成在肿瘤的发生、发展中具有非常重要的地位，此外在肿瘤的转移中，也扮演着重要角色[11]。Kitamura等[12]报道，体外实验显示Girdin蛋白参与VEGF介导的血管生成作用，剔除Girdin蛋白可导致血管生成受抑制。

本研究通过测定乳腺癌组织中Girdin蛋白的表达以及分析其与临床病理参数的关系后发现，Girdin蛋白在乳腺癌中的表达上调与肿瘤远处转移密切相关，其过度表达显示更短的无瘤生存期，进一步证实Girdin蛋白有促进肿瘤侵袭与转移的作用。本文乳腺癌患者的随访结果经Kaplan-Meier生存曲线分析，Girdin蛋白阳性患者生存期低于Girdin蛋白阴性，差异有统计学意义，故笔者认为通过对乳腺癌患者进行Girdin蛋白检测，其结果有助于对患者做出临床预后的评估。

综上所述，本研究结果显示，在正常乳腺组织、单纯性导管上皮增生、导管内癌及浸润性乳腺癌中，Girdin蛋白阳性表达率呈逐级上调；而且Girdin表蛋白达与乳腺癌进展、浸润、转移关系密切，并影响患者的预后。因此Girdin蛋白可作为乳腺癌一个重要的预后标志物，有望为乳腺癌的诊断和治疗提供一条新的途径，但实际应用仍有待于进一步积累资料和研究。

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[5] Jiang P,Enomoto A,Jijiwa M,et al．An actin-binding protein Girdin regulates the motility of breast can cer cells[J]．Cancer Res,2008,68(5)：1310-1318．

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[12]Kitamura T,Asai N,Enomoto A,et al．Regulation of VEGF-medi-ated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin[J]．Nat Cell Bi-ol,2008,10(3)：329-337．

Expression of Girdin in breast cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of Girdin in breast cancer and its clinicopathological significance．MethodsEnvision immunohistochemical method was used to assess the expression of Girdin in 128 cases of invasive breast cancer,38 cases of breast cancer in situ,30 cases of ductal epithelial simple hyperplasia and 30 normal breast tissue samples．The clinicopathological significance of Girdin expression was evaluated．ResultsThe positive expression of Girdin in normal tissues,simple ductal epithelial hyperplasia,breast cancer in situ and invasive breast cancer was 10．0%,23．3%,42．1%and 51．6% respectively;there were significant differences among groups(P＜0．05)．The expression of Girdin in invasive breast cancer was positively correlated with TNM grading,lymph node metastasis and HER-2 expression;it was negatively correlated with the survival time of patients(all P＜0．05)．ConclusionThe Girdin protein may be involved in the development of breast cancer．The expression of Girdin can be used as a predictor for outcomes of invasive breast cancer．

Breast cancer Girdin Immunohistochemical Prognosis Girdin蛋白是日本学者于2005年首先发现的一种新的肌动结合蛋白，在调节细胞增殖及促进肿瘤细胞的运动等方面具有重要作用[1-3]。近年来，越来越多的研究表明，Girdin蛋白在肿瘤发生、发展中起到重要作用，尤其在乳腺癌中的地位更显重要。本研究通过免疫组化方法检测Girdin蛋白在乳腺癌组织中的表达情况，并结合各项临床病理参数进行分析，旨在进一步探讨其在乳腺癌临床诊治中的意义。