橡胶树与白粉病菌Oidium heveae亲和互作组织细胞学研究

万三连， 梁 鹏， 刘文波， 张 宇， 缪卫国， 郑服丛

（海南省热带生物资源可持续利用重点实验室／海南大学环境与植物保护学院，海口 570228）

橡胶树与白粉病菌Oidium heveae亲和互作组织细胞学研究

万三连， 梁 鹏， 刘文波， 张 宇， 缪卫国*， 郑服丛*

（海南省热带生物资源可持续利用重点实验室／海南大学环境与植物保护学院，海口 570228）

摘要白粉病是橡胶树生产中最重要的病害之一，是由粉孢属病菌Oidium heveae Steinm.引起。目前，对该病原菌在寄主中侵染行为及其与寄主互作的组织细胞学尚缺乏系统研究。本文利用显微技术，结合多种染色方法，观察了橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶组织的细胞学变化及寄主的抗性反应。O.heveae在寄主上发育要经历5个关键发育时间点，即分生孢子萌发高峰（4 hpi）、附着胞形成高峰（8 hpi）、侵入结构（初生吸器）形成高峰（15 hpi）、次生菌丝形成高峰（24 hpi）、分生孢子梗形成高峰（5 dpi）；分生孢子萌发侵入寄主前，其能量来自自身贮存的能量物质。在互作过程中，病原菌初生吸器形成之后，橡胶树叶组织开始出现明显的氧暴发、胼胝质和乳突等抗性反应，活性氧在橡胶树与病原菌互作中起到了重要的作用，当橡胶树叶片中活性氧积累较低时，有利于O.heveae的发育及入侵，活性氧积累较高时，则引发寄主氧暴发等以阻止病原菌进一步扩展。O.heveae在寄主上发育的5个关键发育时间点分别属于病原菌侵染前期、潜育期和侵染后期，橡胶树叶组织早期亲和互作与中后期非亲和互作保持了专性寄生菌与寄主间发育平衡的进化关系。

关键词橡胶树； 橡胶树白粉菌； 侵染； 细胞学

橡胶树是热带及亚热带的重要经济林木，橡胶树白粉菌（Oidium heveae Steinm.）是引起橡胶树白粉病的病原菌［1］。橡胶树白粉病最早1918年报道于印尼爪哇，自1951年中国首次报道在海南发现后，相继在中国的各植胶区都有发现［2-3］，目前已成为我国早春防治橡胶树“两病一虫”的重点［3］，该病在适宜条件下具有发病快危害重的特点，严重感病时还可能造成第二次落叶［2，4-5］，使干胶产量明显减少。橡胶树白粉菌是一种活体专性寄生菌，无法进行离体培养，国内外学者对橡胶树白粉病病原菌进行了一定的探索性研究，在病原生物学方面，对其在叶片上的入侵情况进行了初步的形态学方面的描述［6-9］。在寄主与病原菌互作方面，一些研究认为寄主角质层的厚度与抗病性存在一定正相关性［10-11］，而原生质体大小仅在橡胶抗病品系的抗病性中可能具有重要作用，但研究者们未在橡胶品系中发现过敏性坏死反应，以及其他主动抗病反应，如胼胝体、木栓层等［11］。前人的研究结果多集中于橡胶树白粉病菌侵染中后期寄主的表现行为，以及对该病害防治措施的探讨，而对于病原菌在橡胶树叶片上的具体侵染行为、侵染时期及对病原菌与寄主互作尚缺乏详细的研究，尤其对于病原菌侵染前期或入侵早期的研究相对较少。橡胶树白粉病菌4～8 d就繁殖一代，病害发生快［5］，因此探究橡胶树白粉菌在寄主上的各发育关键性阶段，及侵染后寄主细胞做出的反应，有助于理解病原菌对寄主侵染行为及橡胶树感病的原因，对提前预警流行、及早采取防治对策阻止病害的传播与危害具有重要的理论意义和应用价值。

由于禾谷类等寄主在受到白粉菌等病原物入侵时，可能会产生乳突、胼胝质或者过敏性反应来阻止病原菌的入侵或者入侵后的扩展，可能会激发活性氧的迸发，而活性氧迸发被认为是过敏性的特征反应，也是植物与病原菌应答的、最早期防卫反应之一［12-13］，同时被侵染的细胞及其邻近细胞的细胞质可能会形成颗粒状或者细胞会溃散［11，14］。在白粉菌与大麦及小麦的互作研究中表明，不管是通过加固细胞壁（形成有效的乳突），或通过诱导过敏性反应［13］，H2O2在寄主对白粉菌的抗性中起到了非常重要的作用。但是到目前为止，在有关白粉菌与橡胶树的互作研究中还没有发现相关的报道。

本研究的目的是检查橡胶树白粉病在寄主叶片上的早期病状并且利用本实验室单斑分离并保存的橡胶树白粉菌（O.heveae）HO-73菌株，与橡胶树品系‘热研73-3-97’组成亲和性互作组合，在人工控制的环境下，利用Lugol、Nile Red、DAB及考马斯亮蓝等染色技术，结合显微技术观察白粉菌侵染橡胶树叶片组织时的早期症状及确定分生孢子的萌发以及侵染过程的各关键时间点，同时观察了寄主对病原菌入侵做出的反应。通过明确白粉菌与橡胶树叶片互作时的各关键时间点，以及H2O2和胼胝质是否在寄主早期防卫反应中起到一定的作用，为揭示橡胶树叶片与白粉菌互作机制及对橡胶白粉菌的抗病机理奠定基础，并可能为橡胶树白粉病提前进行更经济有效的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

橡胶树品系：‘热研73-3-97’，本试验均采用大古铜期叶片，叶片颜色为古铜色且柔软。

供试菌种：采自海南省儋州市橡胶林，经单斑分离纯化保存的橡胶树白粉菌菌种HO-73，接种至橡胶树大古铜期叶片上，并保持12 d，在接种前24 h轻摇感病叶片以除去老死孢子，采用24时龄的新生的白粉菌孢子作为本试验所用菌种。

1.2 接种方法

为有效防止自然病原侵染，试验在隔离的恒温恒湿培养室内进行，同时对将要接种植株的新梢，在抽芽时即进行套袋隔离。选择橡胶树幼苗大古铜期叶片，取1×106个／m L分生孢子菌悬液10μL定点接种橡胶树叶片，接种后置于温度20～23℃、湿度＞60%的温室内。试验设3次重复，每重复30株。

1.3 光镜样品制备及显微观察

1.3.1 考马斯亮蓝染色

将接种病原菌0、4、8、12、15、24、48 h及3、5、7 d后的橡胶树叶片分别取样，每次用打孔器随机取下直径为1.5 cm的叶碟3片，参照Wolf等［15］的考马斯亮蓝染色方法染色。染色后，存贮于V（冰乙酸）∶V（甘油）∶V（水）＝5∶20∶75的混合液中，以水为浮载剂，采用光学显微镜（Olympus BX51）观察和记载病原菌在寄主叶面上的分生孢子萌发、附着胞形成、初生或者次生菌丝形成的时间和比率（%）等，每个处理随机统计100个孢子，而分生孢子梗的形成时间则随机统计30个孢子，高峰期以观察靶标超过观察个体总量的50%计算。

1.3.2 寄主细胞应对橡胶树白粉菌侵染的H2O2原位检测

按照1.3.1中的采样方法取样，参照Miao等［16］的DAB染色法，并结合Stone等［17］的苯胺蓝染色法，将染色后的样品用50%的甘油固定保存，镜检时以水为浮载剂，用光学显微镜（Olympus BX51）观察并拍照，通过定性观察叶片是否出现红褐色沉淀及沉淀的多少，反映叶片产生H2O2的强弱；利用苯胺蓝来检测胼胝质的形成，在395 nm波长的紫外激发光下观察到蓝色光，用Olympus BX51来观察染色的叶片，分别在接种0、4、8、12、15、24、48 h观测并记载乳突形成率、胼胝质形成率及过敏性反应形成率（%）；每个处理随机检查30个侵染点。

1.3.3 寄主细胞坏死斑的观察

按照1.3.1中的采样方法取样，采用Vogel等［18］的台盼蓝染色，检测寄主叶组织中的坏死斑及真菌菌丝。首先用乙醇乳酚清洗脱色，乙醇乳酚包含1体积的乳酚（V酚∶V甘油∶V乳酸∶V水＝1∶1∶1∶1）及2体积的乙醇，然后用乳酚冲洗后，将样品置于含250μg／m L台盼蓝染液的试管中，沸水浴2 min，紧接着冷却1 h，随后在乳酚中脱色1 h。最后，样品保存于50%的甘油中，镜检时以水为浮载剂，用光学显微镜（Olympus BX51）观察是否存在坏死斑，记录并拍照。

1.3.4 Lugol染色及Nile Red染色

将供试白粉菌置于玻片上，采用Lugol及Nile Red两种染色方法［19］，分别对玻片表面的HO-73分生孢子的萌发过程进行染色观察。Lugol染色法是将样品玻片直接置于Lugol染液中迅速染色，在光学显微镜下分生孢子中糖原呈棕黄色，淀粉呈蓝色。Nile Red染色法是直接将样品玻片置于Nile Red染液中染色5～10 min，用PBS（phosphate buffer solution，PBS）冲洗3次，于450～490 nm激发光下观察。Lugol染液的组成：60 mg／L KI，10 mg／L I2，0.1%Triton X-100（9-diethylamino-5H-benzo［a］phenoxazine-5-one；Sigma）。Nile Red染液的组成：50 mmol／L Tris／maleate缓冲液（p H 7.5），20 mg／mL PVP（polyvinylpyrrolidone，PVP），2.5 mg／mL Nile Red噁酮，0.1%Triton X-100。

1.4 扫描电镜样品制备及观察

按照1.3.1中的采样时间进行取样，将样品切成约0.5 cm2小块，参照康振生等［20-21］方法，制备用于扫描电镜检查的样品：在4%戊二醛（PBS，p H＝6.8）中固定8 h，之后用0.1 mol／L的PBS漂洗3次并浸泡8 h，用系列乙醇（30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%乙醇）分别脱水20 min；100%乙醇脱水置换3次，每次20 min；醋酸异戊酯交换处理2次，每次30 min；CO2临界点干燥，离子溅射镀金后，将处理好的样品置于扫描电镜（日立Hitachi S-3000N）下拍照观察。每处理重复3次。

1.5 共聚焦显微镜样品制备及观察

按照1.3.1中的采样时间进行取样，首先用乙醇乳酚清洗脱色后，参照Xu等［22］的方法，将样品置于含DAPI染液中染色5～10 min，用PBS冲洗3次，于紫外光下，智能激光扫描共聚焦显微镜（OLYMPUS，FV10i）观察。DAPI染液的组成：1μg／m L DAPI（Beyotime）和0.1%Triton X-100（9-diethylamino-5 H-benzo［a］phenoxazine-5-one；Sigma）溶于PBS溶液中。

1.6 橡胶树叶组织内H2O2含量测定

H2O2可以与钼酸作用生成一种络合物，在405 nm处测定其生成量可计算出H2O2的量。参照Jiang等［23］的方法，分别于接种后0、0.5、2、4、8、12、15、24、30、36 h，采用直径1 cm打孔器取橡胶树叶片，使用H2O2测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），按照试剂盒的说明书测定橡胶树叶组织内H2O2含量，每个样进行3次生物学重复，并设健康的橡胶树叶片为对照。

2 结果

2.1 白粉菌侵染橡胶树叶组织过程中的发育关键时间点

运用光学显微镜和扫描电镜技术对白粉菌在感病寄主上侵染过程的组织病理学及超微结构进行观察。试验结果表明，O.heveae在感病寄主橡胶树‘热研73-3-97’上侵染过程分6个阶段（图1～3）：分生孢子附着、分生孢子萌发、附着胞形成、吸器产生、菌丝形成与生长、分生孢子形成。分生孢子（图2a）落于叶片表面2 h后，少量分生孢子开始从其近末端萌发长出初生芽管（图2b），或分叉生长，4 hpi（hours post inoculation，hpi）达到分生孢子萌发高峰期（图1），每个分生孢子可产生1条芽管，有极少数长出2条芽管，随后初生芽管的顶端细胞形成椭圆或球状突起（图2b，c），而后逐渐膨大形成附着胞（图2c、图3a，8 hpi），附着胞与芽管之间有隔膜（图3a，15 hpi），附着胞紧贴于寄主的表面。附着胞由于液泡的聚集形成，从附着胞的中间产生垂直于寄主的侵入钉（图2e），侵入钉作用于寄主的角质层及表皮细胞，若第一次侵染未成功便在附着胞另一侧产生分瓣，形成耳垂状结构，以进行第二次侵染（图2d、图3a，8 hpi），8 hpi达到附着胞形成高峰期（图1）。在附着胞形成时期，橡胶树白粉菌分生孢子中的细胞质通过芽管积聚到附着胞，并形成一定的膨压，导致寄主细胞的叶片有极轻微的下凹现象（图2d、图4b），这说明病原菌侵入寄主的时候可能产生了一定的机械压力。多数分生孢子都会经历两次或者两次以上的侵染尝试，从而形成耳垂状的附着胞。15 hpi后，侵入钉成功进入到叶片表皮细胞后，开始发挥其功能，末端膨大，形成不规则状吸器（图2d），并获取寄主体内营养。15 hpi从附着胞芽管分化生成次生菌丝（图3a），24～48 hpi，寄主表面形成的次生菌丝开始继续分支，产生更多的次生菌丝（图3）；到72 hpi时即接种后3 d（day post inoculation，dpi）肉眼可在叶片上看到交错生长的菌丝（图3a，b），形成网状结构；5 dpi产生分生孢子梗（图3a，b），上端产生具圆形末端初生分生孢子，此时整个侵染循环过程已完成，而初生分生孢子落于叶片表面后，准备萌发，开始下一个侵染循环，此时叶片上方已可见明显白色粉状物（图3b）。

图1 接种后不同时间白粉菌在寄主表面生长发育Fig.1 Different stages of Oidium heveae growth and development after inoculation

图2 显微观察白粉病菌在寄主上的生长发育形态Fig.2 Microscopic analysis of developmental morphology of O.heveae in the host

与病原菌生长发育观察同步，在病原菌孢子附着到叶片后2 d，可以在接种点肉眼或者借助放大镜看到很细小的菌丝体（图3b），3 dpi接种点菌丝体的扩展速度明显加快，3 dpi菌落长、宽度较2 dpi增加近1倍，菌落面积增加2倍，接种点表现为肉眼可见的白色潜育斑，菌丝生长稀疏，接种点叶组织显轻微皱缩；4 dpi，菌丝生长变得稠密，接种点菌落面积又扩大1倍，部分接种点叶组织皱缩并呈现扭曲状；5～6 dpi后，在接种点周围已经形成典型的橡胶树白粉病粉层症状，但成扭曲状的叶组织有恢复平展的趋势。

图3 白粉病菌的细胞学行为观察及其侵染橡胶树叶片的症状形成过程Fig.3 Cytological analysis of O.heveae on the leaf surface and the symptom development in the rubber tree

在7 dpi，在感病叶片初期的银白色辐射状菌丝部位，后期在病斑上出现粉层，形成大小不一的白色病斑，从几毫米到几厘米不等，有时由于多个病斑联合覆盖了几乎整个叶片，严重时病叶皱缩畸形、变黄、最后脱落。在后期随着叶片的老化及温度的升高，病斑可变成红色斑（条件适宜具有较强的再侵染力）、白色癣状斑（条件适宜具有较强的再侵染力）、黄色斑（条件适宜再侵染力已降低甚至消失）和不规则的褐色坏死斑（条件适宜再侵染力已消失）。

综上所述，橡胶树白粉菌侵染寄主有5个关键时间点：（1）接种后4 h为分生孢子萌发高峰；（2）接种后8 h为附着胞产生高峰；（3）接种后12～15 h，为侵入结构及初生吸器产生高峰；（4）接种后15～24 h，为次生菌丝形成高峰；（5）接种后5 d，为分生孢子梗形成高峰，这为初侵染后完成第二次侵染提供大量的菌源。在5个关键时间点中，前3个属于侵染前期，第4个属于潜育期，第5个属于侵染后期。

2.2 寄主细胞对于橡胶树白粉菌的入侵反应

2.2.1 寄主细胞无坏死反应却产生氧暴发和胼胝质等抗性反应

如果橡胶树白粉菌的侵染破坏了橡胶树叶片的细胞膜，则台盼蓝会进入到其细胞质，而健康的橡胶树叶片细胞膜完好，台盼蓝不会进入，因而细胞也不会被染色［24］。通常采用此方法检测寄主细胞是否死亡。在本试验中经连续观察发现，在侵染早中期（0～48 hpi）均没有发现有寄主细胞被染成蓝色（图4c），说明在侵染中前期O.heveae并未对寄主细胞产生破坏性行为。

乳突反应是寄主对白粉病菌入侵产生的一种典型的非专化性防卫反应［25］，乳突中含有可溶性蛋白、过氧化氢、胼胝体及酚类物质［26］。采用苯胺蓝染色，乳突会呈蓝色，由于白粉菌菌丝同样会被苯胺蓝染成蓝色，而胼胝质与苯胺蓝结合会产生蓝色荧光，因此，在使用普通光观察的同时，也采用395 nm激发波长及495 nm发射波长观察是否有蓝色荧光，以确定胼胝质的产生。利用DAB法的原位组织化学染色法主要用于检测寄主细胞中H2O2的积累［16］，可以通过内源过氧化物酶，使DAB与H2O2结合形成红褐色聚合物，来检测过氧化氢生成的位点，但DAB检测无法看到病菌孢子及菌丝结构，因此再通过苯胺蓝染色可观察接种点病原菌的形态和胼胝质的形成。观察结果显示在病原菌侵染寄主过程中，产生初生吸器之前，未看到寄主产生抗性反应，但在15 hpi之后，能够观察到寄主产生了一系列的抗性反应，15 hpi病菌诱导寄主表皮细胞产生乳突，病原菌受到寄主抗性应答后，附着胞呈现分瓣的畸形现象（图4a），同时，一些附着胞意图与寄主建立寄生关系时，附着胞下方的寄主叶肉细胞经DAB染色呈现褐色沉淀，说明寄主积累H2O2，产生了氧暴发，氧暴发现象在36 hpi和3 dpi的检测中均出现在寄主表细胞上（图4c，e），且越到后期发现出现氧暴发的现象越为明显，在侵染早期只有少量呈棕褐色的细胞出现，少于10%。36 hpi，3 dpi病菌初生附着胞在引起寄主表皮细胞产生乳突（图4d）的同时，也激发其产生胼胝质沉积，叶肉细胞经苯胺蓝染色呈现荧光（图4d、4f），但是在15 hpi的时候却未发现有荧光现象出现在次生附着胞的下方，表明侵染早期并没有胼胝质的抗性反应。

图4 不同时段O.heveae诱导寄主细胞产生抗性反应*Fig.4 Host resistance responses induced by O.heveae*

2.2.2 侵染中后期寄主细胞会激发氧暴发阻止病原菌扩展

如果白粉菌的侵染影响了橡胶树叶组织的正常生长，橡胶树叶组织产生氧暴发，经DAB染色的表皮细胞上面有棕褐色沉淀。而在侵染的中后期（24～48 hpi）发现棕褐色细胞数量较侵染前期快速增加，棕褐色沉淀首先出现在受侵染的表皮细胞的细胞壁（图5 A、a）及其下方叶肉细胞（图5B、b），而后才到表皮细胞（图5C、c），且邻近的细胞也受其影响开始出现有棕褐色沉积反应并影响到了下层的叶肉细胞，叶肉细胞出现棕褐色沉淀，存在H2O2积累（图6a）。

图5 DAB染色后在侵染位点亚细胞间H2O2积累的检测Fig.5 DAB stain detection of H2O2accumulation in different subcellular locations at infection sites

通过对吸器与寄主细胞接触面观察发现，感病寄主表皮细胞，在病原菌侵染钉的周围产生了乳突（图6b），同时下方的叶肉细胞出现较弱的黄色，表明此时其下方的叶肉细胞也被激发产生了主动的氧暴发现象。但是在次生附着胞的下方就算是没有明显看到有侵染钉时，也可能会诱导寄主表皮细胞产生少量的氧暴发现象（图6c）。在我们的试验观察中发现，在侵染的后期，并不是所有的次生附着胞都会诱导产生H2O2，在受侵染的表皮细胞中，次生吸器不仅影响受侵染钉入侵的表皮细胞，同时还可能影响到邻近的表皮细胞，并使得周围几个表皮细胞壁溃败、融合（图6d）。尽管橡胶树白粉菌产生的吸器只侵染橡胶树叶片的表皮细胞，但随着病原菌侵染扩张对寄主表皮下方叶肉细胞也造成一定影响。H2O2先在吸器的下端叶肉细胞积累数小时（图4a、5b）；而后，受刺激的持续影响积累的第二波，使表皮细胞壁染色明显加深（图5a、6a），这是由于受侵细胞不断向侵入孔的周围分泌沉积物质形成细胞壁沉积或者胼胝体等（图4d、4f），H2O2继续会充满整个被侵染的表皮细胞（图4c、6b），从而诱导寄主细胞产生氧暴发，同时将信号传递给邻近的细胞，使得周围的细胞产生一定程度氧暴发（图6a、6d）。因此，受侵染的寄主经历了氧暴发的出现－氧暴发现象快速增加－接种点邻近的细胞出现氧暴发的过程。

图6 接种后48～72 h橡胶树白粉病菌激发寄主组织产生抗性反应Fig.6 Host resistance responses induced by O.heveae at 48－72 hpi

检测接种后寄主叶组织中H2O2含量，并与健康橡胶树叶组织对比（表1），发现病原菌附着于寄主表面时（0～4 hpi），叶片中H2O2含量没有明显变化，但是在4 hpi－分生孢子萌发高峰，12 hpi－侵染钉形成入侵的高峰期及24 hpi－次生菌丝形成的高峰时间段，叶组织中H2O2含量出现明显的下降，但是在8 hpi－附着胞形成的高峰期，叶组织中H2O2含量出现明显的上升，恢复到接近初始的阶段，而在15 hpi－初生吸器侵入到寄主细胞中的高峰点，叶组织中H2O2含量回升，而在次生菌丝出现，即表示侵染成功之后已开始从寄主体内吸取营养，其H2O2含量又开始慢慢回升接近正常叶片的水平。

表1 接种后不同时间测得的H2O2含量Table 1 H2O2content in different time points after inoculation

2.3 孢子萌发过程中糖原及脂肪变化

糖原及脂肪是两种能量贮存物质，Lugol染液与糖原反应呈棕褐色，而与支链淀粉或者糊精类反应则呈淡棕色或者浅黄色［16］。采用Lugol染色液观察不同发育期的O.heveae分生孢子（图7），可以看到，在萌发过程中，随着芽管不断伸长，分生孢子棕褐色越来越淡，并逐渐向芽管端聚集呈深棕褐色（图7a～c）。采用Nile Red染色，O.heveae分生孢子红色荧光呈慢慢变弱的态势，且其荧光的聚集是从孢子内部通过芽管输入到芽管顶端细胞及附着胞中，随着附着胞的形成，红色荧光逐渐变强（图7d～f）。在萌发过程中分生孢子消耗了本身贮存的糖原及脂肪等物质，随着孢子的生长发育，其颜色越来越弱，说明糖原及脂肪不断被分解，以提供能量给孢子的生长发育，芽管只起到输送营养的作用，并不积累或者贮存营养。

图7 糖原及脂质在孢子发育过程中的变化Fig.7 Glycogen and lipid changes in conidia development process

3 讨论

橡胶树白粉菌作为一种专性寄生菌，4～8 d就繁殖一代，病害发生快，一般肉眼可见病斑时，已是病原菌接触到寄主表面并开始大量扩展及产孢。已有研究报道O.heveae在接触到叶片2 h萌发，在活体4 h产生芽管和附着胞，而在离体12 h才产生伸长芽管和附着胞，10～12 h达到病菌孢子萌发高峰［7，10］，但对其他各时期具体发育时间并没有确切的说法。在本试验中我们发现O.heveae分生孢子在落于叶片表面大约4 h后，已达到其萌发高峰期，并确定了其他生长发育结构或者侵染结构形成的开始时间与高峰，而肉眼可见的白粉病症状出现在接种后3 d。因此，相对肉眼观察白粉病症状形成及其相应的防治时期，在有利于白粉病发生的物候期中，可将防治时期再提前2～3 d。

病原菌侵入寄主所需的机械压力或所需的酶是否来自于O.heveae自身分生孢子液泡中的内含物尚不清楚。在分生孢子中存在大量的液泡，且在自由水中会导致白粉菌液泡吸水膨胀破裂而释放出有害物质影响孢子的正常萌发［9］，在7 g／L葡萄糖水溶液中能保存完整的形态并进行正常的萌发及产生附着胞等（试验结果待发表），正是由于葡萄糖溶液中保持了一定的渗透压，使得分生孢子内外的渗透压达到平衡。这似乎说明了真菌中细胞的渗透压是维持菌丝生长及入侵机械力的主要动力来源。我们通过多种染色方法在菌丝中发现存在有大量的液泡流动（图片未显示），液泡中携带众多的酚、蛋白、细胞壁合成酶类等，液泡膜在生长顶端与菌丝细胞的质膜融合聚集，形成突起（图2c）。菌丝形态和分支特点主要靠液泡的释放速度和液泡输送中心的线性转移来控制［27-28］。病原真菌的侵入钉在侵染过程中将遇到很高的机械阻力，通过调整细胞壁的强度和液泡的聚集，芽管的顶端细胞即膨大的附着胞产生一定的膨压而使压力集中，形成侵入钉，侵入钉垂直于寄主的表面，并给寄主表皮细胞施压，使其穿透寄主的表皮细胞，最终形成有效的侵入生长结构［29］，但尚不清楚侵入钉在侵入寄主时是否仅靠机械压力。我们在显微观察中看到一些附着胞周围会产生类似于黏液的物质，这些物质是来自寄主还是病原菌以及是否与病原菌成功建立侵染有关尚待进一步研究。

寄主在受到病原物入侵时，可能会产生乳突或者氧暴发来阻止病原菌的入侵或者入侵后的扩展，同时被侵染的细胞及其邻近细胞的细胞质可能会形成颗粒状或者细胞会溃散［30-31］。大麦和小麦白粉菌在寄主表面发育及侵入后寄主也做出相应的回应，如产生乳突、胼胝质等［12］，同时侵入寄主后可能会激发活性氧的迸发，而活性氧迸发被认为是过敏性的特征反应，也是植物对病原菌进行应答的最早期防卫反应之一［13］。H2O2在其对白粉菌的抗性中起到了非常重要的作用，是通过加固细胞壁（形成有效的乳突），或诱导过敏性反应。在本研究中发现，侵染点附近的附着胞存在两个或者多个耳垂状结构，这说明附着胞尝试两次或者多次的入侵。尽管在少量的O.heveae耳垂体状附着胞下方存在H2O2的积累、胼胝质及乳突出现（图4a、6b），但是并没有完全阻止病原菌在寄主叶片表面进一步的入侵尝试，同时在侵染点附近的表皮细胞细胞壁稍变厚，应是受侵染的寄主细胞不断向吸器颈部分泌沉积物质而使细胞壁加厚［10］。

有意思的是，在本研究中，病原菌在侵染寄主叶组织时，寄主表皮细胞似乎表现消极的抵抗，很少产生或者延迟产生氧暴发，而寄主叶肉细胞则会较快产生明显的氧暴发。此结果与大麦－白粉菌病原系统结果类似，由Mla12调控的小种特异性抗性中，寄主通常是在表皮细胞被侵染的24 h内死亡，并且将入侵信号迅速地传递到邻近的叶肉细胞层。在禾谷类作物的白粉菌中，Li等人［13］发现在病原菌接种后14 h，H2O2首先在叶肉细胞中积累，接种后20～24 h，再在表皮细胞中积累，因此早期H2O2的积累是在叶肉细胞中，而后慢慢影响到寄主叶片的表皮细胞，并诱导积累H2O2。

在本试验中，我们未检测到过敏性坏死反应，虽然在侵染早期检测到乳突或者胼胝质等抗性反应，但是寄主并没有完全形成有效的物理屏障以阻止白粉菌的入侵，在接菌后的24 h～3 d时段中，发现有大量的氧暴发（图4e），氧暴发首先出现在叶肉细胞或者细胞壁，随后才出现在表皮细胞及邻近的细胞，以阻止病原菌的进一步扩展。这说明寄主对于橡胶树白粉菌的反应有一定的延时，当白粉菌已经完全侵入到寄主，与寄主建立起寄生关系后，才产生相应的寄主抗性反应，以期阻止白粉菌的进一步扩展。然而在此时，白粉菌可以从其他寄主细胞中获取营养，并继续随着次生菌丝的分化及伸长而形成更多的次生吸器，以供其完成生活史，此时寄主与病原菌可能处于一个互作的平衡体系［32-33］，这可能是专性寄生菌与寄主共同进化的结果。

分生孢子中能量的来源是糖原及脂肪物质［19］。Lugol染色发现，分生孢子在萌发过程中，颜色越来越浅，并在萌发时，首先集聚到近末端（图7b）即芽管萌发的位点，说明在萌发的过程中，在液泡往芽管顶端输送的过程中，内源能量物质慢慢地被消耗。有学者的试验表明，如果加入某些外源糖原物质［34］，可以有效地阻止分生孢子的死亡，说明不管是在非亲和寄主或者非寄主介质上，其吸器死亡的主要原因是由于内部能量消耗殆尽，而又无法获得外源能量供其持续生长。在其他种类白粉菌的萌发及形成附着胞过程中，发现有相关的代谢途径，及相关基因的上调。在大麦白粉菌萌发过程中，存在与8条糖代谢途径、3条脂肪代谢途径相关基因上调表达［19，32，35］。而对于O.heveae在发育过程中还需要验证是否是相类似的基因参与了此类的代谢、供能过程。

4 结论

综合本文的研究结果，明确了橡胶树白粉病菌分生孢子侵染的生活史，确定了橡胶树白粉病病菌侵染寄主具有5个关键时间点，发现病原菌分生孢子附着寄主叶片萌发，到肉眼可见典型白粉病症状具有2～3 d的物候期，可对制定该病害合理的防治时期提供参考。病菌与寄主互作早期，寄主很少产生抗性反应，但在初生吸器形成后，寄主叶肉细胞至表皮细胞会产生氧暴发、胼胝质、乳突等抗性反应，氧暴发是橡胶树与白粉病菌互作的主要抗性反应，但是未发现寄主产生过敏性坏死反应。因此，对于橡胶树白粉菌这一类专性寄生菌与其寄主的早期亲和互作，及中后期非亲和互作，应是寄主与病原物发育进化平衡发展的一种结果。

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致 谢： 浙江大学胡东维老师在样品制备与细胞结构分析方面提供帮助

中图分类号：Q 932

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.005

收稿日期：2013-07-31

修订日期：2013-09-02

基金项目：国家重大基础研究计划（2011CB111612）；国家自然科学基金（31160359）；国家农业产业技术体系建设专项（CARS-34-GW8）；教育部博士点基金（20104601110004）；海南大学科研启动资金（kyqd1006）

*通信作者E-mail：zhengfucong＠126.com，weiguomiao1105＠126.com

Cytological analysis of compatible interactions between rubber tree and Oidium heveae

Wan Sanlian， Liang Peng， Liu Wenbo， Zhang Yu， Miao Weiguo， Zheng Fucong
（Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresources／College of Environmental and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

AbstractPowdery mildew，a disease caused by Oidium heveae Steinm.is one of the most important leaf diseases that affect rubber tree plantations.Yet，at present there is a lack of systematic cytological research on the infection process and host-pathogen interactions.This study used a combination of various staining techniques and microscopy to observe the O.heveae infection process and the cytological changes in the infected leaves associated with host resistance response.The infection of O.heveae in the host developed through 5 crucial time points：conidia germination peak at 4 hours post infection（hpi），appressoria formation peak（8 hpi），penetration structure（primary haustoria）formation peak（15 hpi），secondary hyphae formation peak（24 hpi）and conidiophore formation peak at 5 days post infection.Prior to haustorium penetration into the host cells，the energy for the process came from conidium’s own energy reserves.After the formation of pathogen’s primary haustoria，in response to pathogen penetration，the rubber tree leaves initiated resistance reactions，including reactive oxygen burst and formation of calluses and papillae.Reactive oxygen species played an important role in the rubber treepathogen interactions.Low ROS levels in the rubber tree leaves allowed the development and penetration of O.heveae.In contrast，high levels of ROS and resultant oxygen burst prevent further pathogen expansion.The development of O.heveae infection in the host proceeded through 5 crucial time points，including the initial peri-od of pathogen infection，latent period and post-infection period.In the leaves of rubber tree，an early phase of compatible host-pathogen interactions and later phase of incompatible interactions preserve the balance in the evolution of obligatory host-pathogen relationships.

Key wordsrubber tree； Oidium heveae； infection； cytology