二维薄层色谱技术的研究进展

方 琳， 姚 帅， 崔亚君*， 吴婉莹

（1.上海中医药大学， 上海 201203， 2.中国科学院上海药物研究所， 上海 201203）

［综 述］

二维薄层色谱技术的研究进展

方 琳1， 姚 帅2， 崔亚君1*， 吴婉莹2

（1.上海中医药大学， 上海 201203， 2.中国科学院上海药物研究所， 上海 201203）

二维薄层色谱是一种新型的薄层色谱技术，主要包括单固定相二维薄层色谱、双固定相二维薄层色谱和二维移植薄层色谱。本文通过查阅国内外文献，对不同二维薄层色谱技术的操作方法及特点、二维薄层色谱图像处理、与其他技术联用的进展进行了介绍，并对其未来发展提出了展望。二维薄层在保留了一维色谱的所有优点的基础上，大大扩充了峰容量，提高了分离效果，可为中药质量控制的发展研究提供新的思路。

二维薄层色谱；中药；单固定相二维薄层色谱；双固定相二维薄层色谱；二维移植薄层色谱

薄 层 色谱法 （ thin layer chromatography， TLC） 是 被 广泛应用于各个领域的一种常用技术，在监测中药分离纯化，中药材、制剂的定性鉴别和质量控制等方面一直发挥着不可替代的作用。中药具有成分复杂多样的特点，有些药材种属来源众多，因此在中药材的采收、加工、流通等过程中容易出现伪劣掺假等行为。中药现代化主要是以现代化各种分离技术反映中药整体轮廓特征。但普通薄层色谱的峰容量十分有限，在中药等成分复杂样品的分析过程中显得力不从心， 于是， 一种更为先进的薄层色谱技术——二维薄层 色谱 （ two-dimensional thin-layer chromatography， 2DTLC） 应运而生。

二维薄层色谱应当满足两个条件：两个维度的分离机制是相互正交的；在第一维中已被分离开的两个物质在第二维展开的过程中依然是分离的［1］。 其在扩充峰容量提高分离效果的基础上，几乎保留了一维色谱的所有优点：采用一次性固定相，样品通常无需净化精制，节约分析成本和时间；结果可视化；所需展开剂量少，节约试剂；固定相和流动相选择范围广；所有斑点贮存在薄层板上，可随时对其重复扫描检测， 得出最佳结果［2］。 1994 年至今共有26 篇相关研究论文发表 （见表 1）， 本文据此对二维薄层色谱进行综述。

表1 二维色谱相关研究论文发表趋势

1 二维薄层色谱分类

根据近年来国内 （见表 2） 和国外 （见表 3） 的实验研究，较为常用的二维色谱大致有3种，单固定相二维色谱、双固定相二维色谱以及二维移植色谱。

1.1 单固定相二维薄层色谱 单固定相二维薄层色谱（2D-TLC on one absorbent）， 即薄层板只有一种固定相涂层。样品在薄层板的一角点状点样，在第一个方向上展开，晾干之后， 旋转 90°， 在第二个方向上再次展开［3］。

为达到较好的分离效果，一般可选择中等极性的固定相，并在两个方向上使用不同的溶剂系统，使两个维度分别为正相展开系统和反相展开系统。当然，理论上也可以在两个维度上都使用相同的展开系统，但这样只是相当于延长了展距，对分离效果并无明显的提升，因此较少被采用。

这里存在着一个问题，由于两次展开都在同一块薄层板上进行，因此第一维所使用的展开剂很可能会对固定相的性质造成一定的影响，为了避免这种情况的发生，在两次展开之间的流动相去除步骤十分关键。倘若第一维展开剂中含水，则干燥过程将十分耗时，且很难控制薄层板的含水量，故建议将含水展开剂放在第二维，以确保方法的重现性。

1.2 双固定相二维薄层色谱 双固定相二维薄层色谱（2D-TLC on bilayer plates）， 即薄层板铺有两种不同的固定相涂层，一种涂层为一窄条带，薄层板的剩余空间铺满另一种涂层。样品在条带涂层的一端点状点样，在第一个方向上展开， 晾干之后， 旋转 90°， 在第二种涂层上进行展开［4］。 第一维固定相还能起到预浓缩的作用， 使第二维展开的条带更细，展开结果更为美观。

双固定相二维色谱也和单固定相二维色谱存在着相同的问题，即两次展开过程之间的干燥问题，但其问题更为严峻，单固定相二维色谱尚可选择将反相系统在第二维展开，但双固定相二维色谱的两个维度已被预制，第一维若为十二烷基硅胶之类的固定相，则只能选择将反相展开系统作为第一维，无法回避控制含水量的问题。

表2 二维薄层色谱技术国内进展

表3 二维薄层色谱技术国外进展

1.3 二维移植薄层色谱 二维移植薄 层色谱 （ graft-TLC）与双固定相二维色谱有些许相似，也是在第一维的固定相展开之后， 旋转 90°， 将样品在另一种固定相上进行展开，但不同之处在于两种固定相是相互独立的，样品从第一相到第二相的转移是通过将两块薄层板面对面放置，部分重合后用夹子固定住，利用洗脱能力较强的展开剂将样品从第一维固定相中推至第二维固定相中［4］。

二维移植色谱可实现多个样品同时展开，只需在第一维展开时将样品并列点在同一块薄层板上，展开过程结束之后沿着展开方向将薄层板裁成狭窄条带，下一步分别转移至各自的相同或不同的第二维固定相进行展开即可。

二维移植色谱与前两种二维色谱相比，有更为广泛的固定相类型可供选择，可在不同的分离维度上选择不同的固定相进行组合，取得更为理想的分离效果。

1.4 其他二维薄层 除了上述 3 种方法， 还有一些未被广泛应用的二维薄层技术。

在第一维展开结束之后，有时很难找到一种合适的展开剂在第二维对所有的物质都能好的分离效果，有人提出了一种在单固定相二维薄层的基础上进行改进的展开方式，在第一维结束之后，将薄层上的样品延着第二维的方向划成几个组分，通过每次保留特定组分的底部固定相而划除其他组分的底部固定相，以保证每次只有一个组分被其专属展开剂所展开，达到每个组分独立展开的目的，其分离效果较单固定相二维薄层有了很大的提高［5］。 这种方法虽然是一种新颖有趣的二维薄层技术，但其操作过程较为繁琐，在固定相的划除过程中，不同人之间操作的偏差较大，对其展开结果影响较大。

另有一种二维薄层，将两块涂层不同的条状薄层板面对面放置，部分重合后用夹子固定住，样品在第一维展开结束之后直接进入第二维展开［6］。 这种薄层展开方式虽然在分离方向上不垂直，但其分离机制正交，也可以被纳入二维色谱的范畴，且这种展开方式效果优于单固定相二维薄层。

2 图像处理技术

采用薄层色谱法分析样品后，获得的轮廓图可以通过摄像以图片的形式保存。传统的方式是一般通过保存的图像得到直观的视觉感官信息，寻找待测样品的特征斑点，并对不同来源的样品进行辨别，此外，也可以通过其他方式来获得更为丰富的数据信息。

一种方法是通过向专业软件导入薄层照片得到相应的色谱峰信息。在导入之前，应对图像进行适当的预处理，减少由于拍摄过程中光线等影响造成的图像失真等情况。二维薄层的图像预处理与一维色谱相似，也可通过灰度变换、去噪、平滑、锐化等预处理方式达到图像复原、增强等目的，以便于在下一步的分析如聚类分析中取得更为客观的结果［23，28-29］。 薄层色谱 在很多时候被认为 是一种定性或半定量技术，其实，如果能够经过适当的图像处理，尤其是扣除背景，定义斑点边缘之后，其不失为一种很好的定量技术［30］。

此外，运用薄层扫描仪可在紫外光或可见光下得到薄层图谱中特征斑点的类似液相的保留时间与峰面积的对应信息。目前的二维薄层扫描使用的是与一维薄层相同的扫描仪， 在一个薄层平面上最多只能呈现 36 条扫描通路［20-21，26-27］， 这对峰容 量 较大， 样品斑 点 分 布 较 为 集 中 的二维色谱来说还不够，需要有更为先进的扫描仪器提供相同面积下更为丰富的扫描通路来展现二维薄层色谱最佳的视觉效果。

对于二维薄层图像处理， Matlab 和 Image J是目前应用最为广泛 的 软件。 Łukasz Komsta［23］等人通 过 Image J对 单固定相二维薄层的结果图像进行了一系列的处理，成功地使斑点得到了客观准确的聚类分析结果。

3 与其他技术联用

通过薄层色谱得到的样品整体数据轮廓，可以对不同种属植物来源药材或相近品种进行鉴别，但要说清楚其不同的特征成分，需要对样品的特征斑点的化合物或一类化合物进行成分识别，除了传统的离线方式将斑点成分逐一提取出来，然而近年来，薄层色谱质谱联用技术尝试了一种在线的成分识别方法。其中，应用最多的是电喷雾解吸电离技术：电喷雾的发射器在距离薄层板2 mm左右的高度并呈一定的角度将带电离子打到薄层板上，待测样品从固定相表面解吸出来并被电离，从而进入质量分析器获得质谱图［22，31］。 现有的薄层 质 谱 联 用 技 术 尚 存 在 一 些 不 足，如待分析斑点浓度较低，不足以获得特征分子量及碎片离子，质谱从薄层板上直接收集待测斑点的空间分辨率较低。

还可以和其他色谱技术如气相色谱 （GC）、 超临界流体色谱 （SFC）、 高效液相色谱等进行联用， 但要实现与这些色谱的联用，需要解决如何将第一维所得化合物组分引到薄层板上的问题。

目前二维薄层色谱与其他技术的联用对仪器设备的要求较高，现有的方法并非所有的实验室都能够实现，随着二维薄层被更多的研究者所认识和重视，我们期待更多它与其他技术的联用方式的出现。

4 二维薄层色谱展望

我国学者早在上个世纪90年代就已开始进行二维薄层色谱的相关研究 （见表 2）， 多集中于单固定相二维薄层，将其应用于单味中药及中药复方成药的研究。虽然在研究过程中取得了较好的分离效果，但展开方式较为单一，且由于当时仪器设备相对简陋，对结果的处理方式还停留在一维薄层色谱水平阶段，并未建立与二维薄层色谱技术相适应的图像分析和数据处理方法，更没有系统的成分识别方法，对其的应用也仅仅局限在作为一种化合物分离技术，并未挖掘出其在中药质量控制方面存在的巨大潜能，和在其他方面的应用价值，因此并未在国内研究者中得到足够的重视，这些可能是今年来国内二维薄层色谱研究工作相对停滞的原因。

而国外学者对二维薄层色谱的研究则显得更加丰富化（见表3）， 开发出各种展开方式， 形成多种图像处理方法，将其广泛地应用于生物化学、生物学、天然药物的分离分析，并且仍在不断地进行新的尝试和探索。

二维薄层色谱的峰容量理论上可达 100 到 250［1］， 但国内外的二维薄层色谱研究中均未实现过如此高的峰容量，表明二维色谱薄层的理论和技术还有很多值得探索之处。

由于供试品和对照品不能在同一块薄层板上进行展开，因此斑点的指认有一定的难度，需要每次展开具有较高的重复性，但目前的二维薄层色谱在两个维度之间进行转换的步骤尚需人力操作，重复性难免不高，故开发合适的色谱专用展开装置甚至自动装置十分有必要。已有人尝试对二维展开装置进行了相关研究［32］， 但目前市场上还并未发现有相关产品，其仍有较大的开发潜力。

作为复杂体系，即使单味中药，其化学组分也极其庞大， 常多于 100 种， 对其进行质量控制研究是目前中药研究的热点和难点。目前已有的质控方法多针对于少数几个特征成分，难以满足近年我国药典修订大纲提出的整体质量控制的要求，而二维薄层色谱不仅仅是一种优秀的分离技术，其极高的峰容量是一维薄层和一维液相所无法媲美的，且其结果重现性也较高，在中药复杂成分质控研究中拥有极大的发展空间。值得引起注意的是，美国药典已经在食品补充剂一册中的西洋参等中药的监测方法中应用了单固定相二维薄层，使二维薄层色谱的质控能力得到了很好的证明。美国药典注重以更加先进的方法更加全面地对可监测到的所有成分即整体轮廓进行质量控制，并以实际行动迈出了这一步，我们有理由相信，在不久的将来，这也会成为我国中药复杂体系整体轮廓质量控制的发展方向。

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2013-07-08

方 琳 （1989—） ， 女， 硕士生， 研究方向： 中药学。 Tel： 13818459120， E-mail： fanglincorn@126.com

*通信作者：崔亚君，女，副教授，研究方向：中药质量标准。