罗汉果甜苷对体外人肝星状细胞活化和凋亡的影响

2014-04-11宋开娟廖长秀刘燕平陈湘芸黄岑汉

中成药 2014年3期

关键词：罗汉果星状胶原

宋开娟，廖长秀，刘燕平，陈湘芸，黄岑汉*

（1.广西中医药大学，广西南宁 530001； 2.右江民族医学院，广西百色 533000）

罗汉果甜苷对体外人肝星状细胞活化和凋亡的影响

宋开娟1，廖长秀2，刘燕平1，陈湘芸1，黄岑汉2*

（1.广西中医药大学，广西南宁 530001； 2.右江民族医学院，广西百色 533000）

目的研究罗汉果甜苷对体外培养人肝星状细胞 LX-2 活化及凋亡的影响。方法体外培养 LX-2，将其分为空白对照组、不同质量浓度的罗汉果甜苷干预组（80、 160、 240、 320 μg/m L），每组 8 瓶细胞，药物与细胞共同孵育24 h 后，采用 CCK-8 试剂检测细胞增殖状态，用酶联免疫吸附法测定转化生长因子-β1 （TGF-β1）和Ⅰ型胶原的蛋白分泌，用 RT-PCR法检测 TGF-β1 和 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的 mRNA的表达。用流式细胞仪双染法检测细胞凋亡。结果 CCK8 结果显示罗汉果甜苷各剂量组作用 LX-2 细胞 24 h 后，细胞增殖均明显降低（ P＜0.05）； ELISA和RT-PCR结果表明，与空白对照组比较，罗汉果甜苷各剂量组可抑制 LX-2 中 TGF-β1 和Ⅰ型胶原的蛋白分泌；并能抑制 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA表达（P＜0.05）。流式细胞检测结果显示罗汉果甜苷各剂量组亦可剂量依赖性显著增加 LX-2 凋亡率。结论罗汉果甜苷可通过抑制 TGF-β1 和 I型胶原的蛋白及 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA的表达来抑制肝星状细胞活化，还能促进肝星状细胞凋亡，从而发挥抗肝纤维化的作用。

罗汉果甜苷；肝星状细胞；活化；凋亡

肝纤维化是肝硬化的早期病变，是由各种慢性肝病引起的慢性肝损伤。肝纤维化发生时，肝内纤维结缔组织异常增生，细胞外基质（extracellular matrix， ECM）的合成和降解失衡，导致 ECM在肝内过度沉积，其中肝星状细胞的活化、增殖并转变为肌成纤维细胞是 ECM的主要来源［1］。罗汉果甜苷是罗汉果提取物的主要有效成分，主要药理作用包括：祛痰、镇咳、清除自由基及抗氧化活性、增强免疫、抗癌［2］，并且有研究证明其对大鼠及小鼠急慢性肝损伤有保护作用，具体作用机制尚不明确［3-5］。为进一步探讨罗汉果甜苷抗肝纤维化的作用机制，本实验采用 CCK8、 RT-PCR和 ELISA等方法，探讨罗汉果甜苷对肝纤维化发生关键细胞——人肝星状细胞 LX-2 活化和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料人肝星状细胞株（LX-2）购于中南大学湘雅中心实验室细胞库；罗汉果甜苷（其成分为罗汉果苷 V，质量分数为 63.49%，含水分量为3.46%，灰分为 0.79%），购于广西桂林莱茵生物科技股份有限公司。胎牛血清、 DMEM培养液购于 Gibco公司； CCK-8 试剂为碧云天生物技术研究所产品； ELISA试剂盒购于上海拜沃生物科技公司； RNA逆转录试剂盒购于 Fermentas公司； SuperReal PreMix为天根公司产品。细胞凋亡试剂盒购于凯基生物。实时荧光定量 PCR仪和凝胶成像分析系统为美国伯乐公司产品；流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 LX-2 置于含 10%胎牛血清的高糖 DMEM培养基、5%CO2、37 ℃、饱和湿度的条件下培养，复苏及传代后次日换液，1～2 d换液，并密切观察培养液颜色及细胞状态，当细胞呈单层覆盖瓶底时，用 0.25%的胰酶消化，按照 1 ∶2 的比例传代。

1.2.2 实验分组及处理空白对照组加入 10%胎牛血清的 DMEM 培养液；用 10% 胎牛血清的DMEM培养液将罗汉果提取物稀释成不同质量浓度，分别为 80、160、 240、 320 μg/mL。待细胞60%融合，更换为无血清培养基同步化24 h，然后再加药干预 24 h。

1.2.3 CCK-8 试剂检测细胞活化用 96 孔板培养细胞，共分 5 组，每组 10 孔细胞，待药物干预 24 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，置 37 ℃恒温振荡箱孵育1 h，在酶联免疫检测仪450 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.4 酶联免疫吸附测定法检测转化生长因子-β1（TGF-β1）和Ⅰ型胶原的蛋白表达根据药物质量浓度将实验分为5组，每组8瓶细胞，将细胞加药干预24 h 后，收集每瓶细胞培养液上清于 1.5 mL EP管，按照 TGF-β1 和Ⅰ型胶原酶联免疫分析试剂盒说明操作，最后使用酶标仪在 450 nm下读取吸光度值，记录数据并绘制标准曲线。

1.2.5 RT-PCR法检测 TGF-β1 和 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA） mRNA的表达药物处理方法同前，设置5 个实验组，每组8 瓶细胞，干预24 h后用Trizol裂解液将细胞裂解，提取总 RNA；用紫外分光光度法检测总 RNA纯度和浓度；按照逆转录试剂盒说明，将总 RNA逆转录成 cDNA。利用 Primer 5.0 设计其引物序列， β-actin 为内参，引物序列及产物长度见表 1。反应条件： 95 ℃预变性 15 min，95 ℃变性 10 s； 60 ℃变性 30 s共 45 个循环； 55℃ ～95 ℃，每 30 s连续升温检测荧光值及扩增产物熔解曲线，共 81 个循环。反应结束后以 β-actin为参照物，计算出各组 mRNA表达情况。

表 1 TGF-β1、 α-SMA和 β-actin引物序列及产物长度Tab.1 TGF-β1， α-SMA and beta actin primers sequences and the length of the product

1.2.6 流式细胞仪双染法检测细胞凋亡设置为5组，每组3瓶细胞，按照实验方法对细胞进行干预后，弃培养液，加入不含 EDTA胰酶消化后，离心，用 PBS 洗涤细胞两次，加入 500 μL Binding Buffer悬浮细胞，加入 5 μL FITC混匀后，再加入5 μL PI混匀，室温避光，反应 15 min 后进行流式细胞仪检测。

1.2.7 统计学处理应用 SPSS 17.0 软件进行统计学处理，计量资料均用均值±标准差表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 CCK-8 试剂检测细胞活化情况细胞培养板孔内细胞加入 CCK-8 试剂后 1 h，可见培养液颜色变浅，且高质量浓度组颜色较低质量浓度组稍浅。80 ～320 μg/m L质量浓度 OD值较空白组均有不同程度降低，随着质量浓度增高，对细胞增殖抑制明显（表2）。

表 2 不同质量浓度罗汉果甜苷对抑制 LX-2 活化的影响（n=10，）Tab.2 Influence on inhibiting LX-2 activation with different concentration mogroside（ n=10，）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05

组别剂量/（μg·mL-1） OD值抑制率/%空白对照组 0.329 ±0.013—罗汉果甜苷组 80 0.305 ±0.008* 7.6罗汉果甜苷组 160 0.272 ±0.037* 17.4罗汉果甜苷组 240 0.228 ±0.032* 48.3罗汉果甜苷组 320 0.171 ±0.017*50.1

2.2 酶联免疫吸附测定法检测 LX-2 培养基中TGF-β1 及Ⅰ型胶原的蛋白分泌量随着罗汉果甜苷质量浓度的增高其 TGF-β1 及Ⅰ型胶原的蛋白表达下降，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表 3）。

表 3 罗汉果甜苷对 LX-2 中Ⅰ型胶原及 TGF-β1 的蛋白表达影响（n=8，）Tab.3 Expression influence on collagenⅠ and TGF-β1 protein with mogroside in LX-2 （ n=8，）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别剂量/（ μg·m L-1）Ⅰ型胶原/（pg·mL-1）TGF-β1/（pg·m L-1）空白对照组17.264 ±0.591 42.261 ±0.991罗汉果甜苷组 80 16.693 ±0.519*32.925 ±0.899*罗汉果甜苷组 160 15.851 ±0.411*24.791 ±0.804**罗汉果甜苷组 240 15.418 ±0.367*20.505 ±0.768*罗汉果甜苷组 320 13.781 ±0.879*18.339 ±0.892*

2.3 RT-PCR法检测 TGF-β1 及 α-SMA mRNA的表达 LX-2 经罗汉果甜苷作用 24 h 后， TGF-β1 的mRNA表达呈下降趋势（见表 4），其中 80 μg/mL及 160 μg/mL药物质量浓度干预后与空白对照组比较无明显差异（P＞0.05），后两组药物质量浓度与空白对照组比较有明显差异（P＜0.05）。 α-SMA的 mRNA表达呈下降趋势， 320 μg/mL药物质量浓度组与空白对照组比较有明显差异（P＜0.05）。

表 4 罗汉果甜苷对 LX-2 中 TGF-β1 和 α-SMA的 m RNA的表达影响（n=8，）Tab.4 Influence on TGF-β1 andα-SMA m RNA exp ression w ith mogroside in LX-2 （ n=8，）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05

组别剂量/（ μg·m L-1）TGF-αβ12-ΔΔCT值SMA2-ΔΔCT值1.074 ±0.451 1.019 ±0.244罗汉果甜苷组 80 0.907 ±0.443 0.742 ±0.443罗汉果甜苷组 160 0.678 ±0.167 0.753 ±0.418罗汉果甜苷组 240 0.430 ±0.414* 0.790 ±0.127罗汉果甜苷组 320 0.426 ±0.254* 0.353 ±0.181空白对照组*

2.4 流式细胞仪双染法检测细胞凋亡结果显示，与空白对照组比较，罗汉果甜苷组作用于 LX-2 24 h，细胞凋亡率增加，且有显著性差异（P＜0.05），其凋亡率随罗汉果甜苷质量浓度增高而升高，见表5。

3 讨论

近年来研究表明，在正常肝脏内，LX-2 处于静止状态，当 LX-2 受到炎性细胞因子等病理因素刺激后，活化并大量增殖，其活化和功能改变是肝纤维化发生的关键。在 LX-2 激活的持续阶段，LX-2 出现很多表型变化，包括增殖、收缩、基质降解、纤维形成、维生素A缺乏和细胞因子释放等。其中 TGF-β1 是最重要的促肝纤维化细胞因子［6-7］，它具有活化 LX-2、促进胶原纤维和 ECM的合成及沉积等多种作用。而反映 LX-2 的活化和向肌成纤维细胞的转化的标志指标为 α-SMA［8］，其表达量的多少可用来衡量肝星状细胞的激活程度［9-10］，随着肝星状细胞培养活化 α-SMA表达逐步增加［11］。同时激活的 LX-2 合成大量的以Ⅰ、 Ⅲ型胶原为主的 ECM［12］，其中Ⅰ型胶原增多最为显著。 Ⅰ型胶原可促进 LX-2 激活、增殖，并抑制肝细胞及窦内皮细胞的增生，促进肝纤维化的发展。因此阻断细胞因子促增殖的作用，将成为治疗肝纤维化的有效手段。

表 5 罗汉果甜苷对 LX-2 凋亡的影响（n=3，）Tab.5 Influence on the LX-2 apoptosis w ith mogroside（n=3，）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05

组别剂量/（μg·m L-1）凋亡率/%空白对照组 —1.97 ±0.15罗汉果甜苷组 80 7.70 ±0.30*罗汉果甜苷组 160 10.16 ±0.23*罗汉果甜苷组 240 14.33 ±0.25*罗汉果甜苷组 320 16.53 ±0.41*

近年来研究证实，罗汉果甜苷除具有祛痰、止咳、润肠通便［13］等作用外，经过实验还证实其有阻止肝细胞脂肪变性［14］，并对肝纤维化大鼠有保护作用［15］，但在该药对 LX-2 的基因和蛋白表达的调节作用还未见报道，因此本实验运用 RT-PCR、ELISA、流式细胞术等方法，检测罗汉果甜苷对LX-2 中 TGF-β1、 Ⅰ型胶原的蛋白及 TGF-β1 和 α-SMA的 mRNA表达的影响及细胞凋亡情况，结果表明，随药物质量浓度增高，药物对 LX-2 的活化抑制作用增强， LX-2 中 TGF-β1， α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白及 mRNA的表达下降，并且细胞凋亡呈下降趋势，这说明罗汉果甜苷可以抑制 LX-2 中TGF-β1， Ⅰ型胶原的蛋白分泌；并能抑制 TGF-β1和 α-SMA、的 mRNA的表达，还能促进细胞凋亡，从而抑制 LX-2 中 ECM的合成，发挥抗肝纤维化的作用。

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Effect of activation and apoptosis ofmogroside on hepatic stellate cell

SONG Kai-juan1， LIAO Zhang-xiu2， LIU Yan-ping1， CHEN Xiang-yun1， HUANG Cen-han2*
（1.Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China； 2.Youjiang Medical College for Nationalities， Baise533000， China）

mogroside； hepatic stellate cell； activation；apoptosis

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）03-0481-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.008

2013-06-12

广西科技攻关课题（0992003A-12； 0898001）；国家自然科学基金（81060040）

宋开娟（1982—），女，硕士生，研究方向：中医诊法与辨证规范化客观化。 E-mail： songkaijuan@163.com

*通信作者：黄岑汉（1959—），男，教授，研究方向：中医诊法与辨证的规范化客观化及民族医药。 E-mail： hchgx@sina.com