土家苗药夜关门对小鼠实验性失眠的疗效观察与机制初探

郜红利， 涂 星， 卢 映， 张 方

（1.湖北民族学院中医药学院， 湖北 恩施 435500； 2.广州中医药大学， 广东 广州 510006； 3.恩施自治州优抚医院， 湖北 恩施 445000）

［科研报道］

土家苗药夜关门对小鼠实验性失眠的疗效观察与机制初探

郜红利1， 涂 星2， 卢 映2， 张 方3

（1.湖北民族学院中医药学院， 湖北 恩施 435500； 2.广州中医药大学， 广东 广州 510006； 3.恩施自治州优抚医院， 湖北 恩施 445000）

目的 探讨土家苗药夜关门对小鼠实验性失眠的药效作用，并进行初步的机理研究。方法 以对氯苯丙氨酸诱导实验型完全失眠小鼠模型，分为正常组、模型组、高、中、低剂量给药组、安定组，分别给予相应药物，观察小鼠一般行为学特征； 取脑组织， 测定超氧化物歧化酶 SOD及 NO水平。 结果 不同剂量的夜关门均能显著性减少模型小鼠 3 min 内活动次数、 改善体表特征、 降低其脑组织中 NO的水平 (P＜0.05)； 中、 高剂量夜关门提取液能显著性降低失眠小鼠脑组织中过高的 SOD水平 (P＜0.05)， 与安定无显著性差异， 高剂量组可使过高的 SOD水平恢复至正常水平。结论 夜关门对对氯苯丙氨酸诱导的失眠小鼠具有较好的治疗作用，该作用可能是通过降低其脑组织中 NO和SOD的水平实现的。

夜关门；对氯苯丙氨酸；睡眠剥夺；一氧化氮；超氧化物歧化酶

失眠 (insomnia) 是指患 者对睡眠时 间和 ( 或) 睡眠质量不满足并影响白天社会功能的一种主观体验，目前常用苯二氮卓类和非苯二氮卓类催眠药物进行治疗，但易产生不良反应或戒断综合征［1］。 持续的觉醒或睡眠剥夺作为一种急性氧化应激对机体免疫、内分泌及神经系统有明显影响，尤其对脑功能的影响十分显著，已有实验证明，睡眠剥夺可出现脑氧化，而大量的自由基和 NO参与了脑神经细胞的毒性损伤［2-3］。 土家苗药夜关门具有 “ 昼开夜合”的生物节律现象，说明其有安神入眠的作用，现代研究表明，其中发挥中枢抑制和镇静作用的成分可能是琥珀酸等［4，5］。 本研究拟 以睡眠剥 夺 小鼠模型 为 研 究 对 象， 考 察土家苗药夜关门对失眠动物的影响，为其安神入眠作用提供合理的依据和参考。

1 材料

1.1 动物与分组 健康 SPF级 SD小鼠 60 只， 体质量(200 ±20)g， 由广州中医药大学实验动物中心提供， 许可证号 SCXK(粤)2013-0020。 将小鼠按照随机数字表法分为模型组 (n=50) 和正常组 (n=10)。 每只小鼠均在相同条件下，自由饮水、摄食，保持自然光节律。

1.2 试剂及药物 对氯苯丙氨酸， 购于美国 Sigma公司；NO、 SOD试剂盒， 购于南京建成生物制剂研究所； 夜关门，采集于湖北省恩施州利川市佛宝山自然森林保护区，经湖北民族学院朱敏英教授鉴定为豆科植物截叶铁扫帚Lespedeza cuneata(Dum.Cours.)G.Don 的全草； 其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备 UV-7504 紫外可见分光光度计 ( 上海欣茂仪器有限公司)； 微量有机分析专用超纯水机 (伊洋企业发展有限公司)； 小鼠自主活动测试仪 (成都泰盟科技有限公司)； Anke TGL-16B离心机； JK5200B超声波清洗器；分析天平等。

1.4 药液的配制 对氯苯丙氨酸液配制: 精密称取对氯苯丙氨酸3.000 0 g， 加弱碱性生理盐水 (pH7 ～8) 溶解并定容至 100 mL， 即得 30 mg/mL的对氯苯丙氨酸混悬液。

夜关门水煎液: 称取夜关门粗粉约 2 000 g， 加 6 倍水煎煮3次， 每次 1 h， 合并煎液， 浓缩至含生药量为1 g/mL， 即得夜关门水煎液， -4 ℃保存备用。

2 方法

2.1 动物造模及给药 模型组小鼠于每天上午 8:00 ～8:30按 10mL/kg用量腹腔注射对氯苯丙氨酸液， 正常组小鼠同时间等量腹腔注射弱碱性生理盐水 (pH7 ～8)， 连续2 d。 动物出现昼夜节律消失， 白天也活动不停， 整体观察与正常对照组有明显不同，表明模型复制成功，剔除不成功的动物模型。 选取失眠模型动物40只， 分为模型对照组、高、中、低剂量给药组及安定组，每组8只。

于第3 天开始每天上午8:00 开始， 参照参考文献 ［6］设定夜关门高、 中、 低剂量分别为 12.3、 6.15、 3.1 mL/kg (夜关门成人日用剂量为 30 g， 其小鼠临床等效剂量为6.15 g/kg)， 安定组 3.1 g/kg灌胃给药， 模型对照组和正常组给予同体积生理盐水， 每天1次， 连续灌胃7 d。

2.2 动物一般行为学观察 末次给药后， 观察比较各组小鼠的体表特征， 并进行积分评分［7］。 评分标准: ①精神状态及对外界的刺激反应；②眼睛眼裂变窄，嗜睡等；③面部、口鼻黏膜和爪；④食欲、体质量和消瘦程度；⑤皮毛毛色和光泽。按照5个等级进行积分，状态好的5分，状态差为1分， 共计25分。

在末次给药1 h后，将小鼠放入自主活动仪中，待小鼠适应 5 min 后， 计数 并 打 印 3 min 内站 立 次 数， 连 续 2次，取平均值进行统计分析。

2.3 SOD、 NO水平的测定 将各组大鼠脱颈椎处死， 剪开头骨，掀去颅骨，以生理盐水洗净后取出大脑，置于吸水纸上称重，吸去多余的水分，称取吸水纸质量，两者之差即为脑组织净重， 置于 -80 ℃液氮中保存。

按照试剂盒说明书， 采用黄嘌呤氧化还原法测试 SOD水平， 采用硝酸还原酶法测定大脑内的 NO水平。

2.4 数据的处理与统计 采用 SPSS 13.0 软件进行统计学分析， 所有检测结果以均数 ±标准差 (-) 表示， 组间比较采用 One-Way ANOVA检验， 双侧检验显著性水平取 α =0.05。

3 结果

3.1 夜关门对小鼠一般行为学的影响 观察发现， 各组小鼠的进食、饮水、排便和毛色的变化无明显差异，但模型组小鼠的眼裂变宽，精神躁动，对外界的刺激产生的应激增强，自主活动加快，给药后上述症状均能得到一定程度的缓解。见表1。

表 1 小鼠一般行为学特征变化分析 （ ¯， n=8）

表 1 小鼠一般行为学特征变化分析 （ ¯， n=8）

注: 与正常对照组比较，*P＜0.05； 与模型对照组比较，△P＜0.05； 与安定对照组比较，▲P＜0.05

组 别3 min 内小鼠活动次数小鼠外观评分正常对照组7.10 ±1.5224.50 ±0.53模型对照组31.13 ±3.44*▲14.63 ±1.19*▲夜关门低剂量组21.25 ±3.33*△▲15.63 ±1.3*▲夜关门中剂量组10.88 ±1.96*△▲20.13 ±1.5*△夜关门高剂量组15.13 ±3.04*△▲19.25 ±1.49*△▲安定阳性对照组5.88 ±9.16△22.38 ±1.19*△

由该研究结果可以看出，给予夜关门不同剂量的提取液后， 均能显著性减少模型大鼠 3 min 内小鼠活动次数(P＜0.05)， 但远不如给予安定所达到的治疗效果。 对于小鼠体表特征的影响而言，不同剂量的夜关门与安定均能显著改善对氯苯丙氨酸所引起的不良生理状态 (P＜0.05)， 且中剂量的夜关门提取液与安定的效果无显著性差异 (P＞0.05)。

3.2 夜关门对小鼠脑组织中 NO和 SOD的影响 由研究结果可知， 对氯苯丙氨酸能导致正常小鼠脑组织中 NO、 SOD水平显著性升高 (P＜0.05)， 提示对氯苯丙氨酸可能是通过引起大鼠脑组织中该类物质的变化而诱导小鼠失眠；不同剂量夜关门提取液均能显著性降低失眠小鼠脑组织中NO水平 (P＜0.05)， 且两者之间无明显的量效关系； 中剂量和高剂量夜关门提取液能显著性降低失眠小鼠脑组织中SOD水平 (P＜0.05)， 低剂量夜关门提取液对 SOD的影响不显著， 提示夜关门对失眠小鼠脑组织中 SOD水平的影响与给药剂量之间存在这一定的量效关系。此外，研究结果显示， 中、 高剂量夜关门提取液降低 SOD水平效果与安定无显著性差异， 高剂量组可使失眠小鼠过高的 SOD水平恢复至正常水平。 见表2。

表 2 夜关门对小鼠脑组织中 NO 和 SOD水平的影响（ ¯， n=8）

表 2 夜关门对小鼠脑组织中 NO 和 SOD水平的影响（ ¯， n=8）

注: 与正常对照组比较，*P＜0.05； 与模型对照组比较，△P＜0.05； 与安定对照组比较，▲P＜0.05

组 别NO/( μmol/gprot)SOD/(U/mgprot )正常对照组3.257 5 ±0.096 6 415.707 5 ±29.952 0模型对照组6.060 0 ±0.183 0*481.138 8 ±32.023 5*夜关门低剂量组5.162 5 ±0.151 4*△▲451.162 5 ±31.524 7夜关门中剂量组4.026 3 ±0.214 0*△▲431.411 3 ±9.432 5△夜关门高剂量组4.198 8 ±0.304 7*△▲417.495 0 ±21.169 3△安定阳性对照组3.038 8 ±0.177 2△429.526 3 ±14.898 9△

4 讨论

4.1 对氯苯丙氨酸诱导失眠模型是目前公认的， 并广泛应用于 5-HT及其与其他递质之间关系研究的经典动物模型［6］， 目前研究表明， 对氯苯丙氨酸失眠模型与中医心肾不交模型的病症相似［8］。 本实验的研究结果表明， 夜关门对对氯苯丙氨酸诱导的失眠小鼠具有较好的治疗作用，能减少其自主活动以及对外界刺激的应激性，提示夜关门可用于心肾不交所致失眠患者临床干预。

4.2 一氧化氮是细胞与细胞间信息传递的重要调节因子，作为第一信使和神经递质在神经系统中具有重要作用。现代研究表明， 剥夺睡眠会导致机体NO产生增多， 而 NO具有促进睡眠的作用，能引起集体疲劳感和睡意。 NO可以通过 cGMP消除氧自由基， 保护脑细胞， 但过量的 NO可以转化成为作用很强的氧自由基， 反而加重脑损伤［9］。 本研究结果表明， 对氯苯丙氨酸剥夺睡眠 48 h后， 大鼠脑内NO水平升高， 而夜关门可以显著降低NO的水平， 避免过量的NO加重脑损伤。

4.3 超氧化物歧化酶 (SOD) 是人体内最重要的自由基清除剂。 现代研究表明， SOD可清除体内过量活性氧， 保护细胞生物膜和脑细胞，其活性高低反应机体清除氧自由基的能力［10-11］。 本实验研究结果表 明， 对氯苯丙氨酸剥夺睡眠 48 h 后， 小鼠脑组织中 SOD活性显著增高， 说明对氯苯丙氨酸可诱导自由基清除系统出现反应性升高。而给以夜关门提取物后脑组织中 SOD水平有所下降， 且其下降趋势与夜关门给药剂量成正比，给以高剂量夜关门提取物时其SOD水平接近正常大鼠脑组织中 SOD水平， 提示夜关门能消除氧自由基，减轻对氯苯丙氨酸所致的小鼠神经细胞损伤，具有较好的脑保护作用，为夜关门缓解失眠提供了实验依据。

本研究是基于对氯苯丙氨酸诱导的实验性失眠模型而展开的，属于短期失眠行为，而失眠是一个复杂而特殊的病理现象，因此本研究还存在一定的缺陷。如何找到一个更切合实际的动物模型，适当地选择与失眠相关的特异性和非特异性指标，还有待进一步深入研究。

［1］ 失眠定义、诊断及药物治疗共识专家组.失眠定义、诊断及药物治疗专家共识 (草案) ［ J］.中华神经科杂志，2006， 39(2):141-143.

［ 2 ］ Damasceno F， Skinner G O， Araújo P C， et al.Nitric oxide modulates the hyperalgesic response tomechanical noxious stimuli in sleep-deprived rats［ J］ .BMCNeurosci， 2013， 14(1): 92.

［ 3 ］ Ramanathan L， Siegel JM.Sleep deprivation under sustained hypoxia protects against oxidative stress［ J］ .Free Radic Biol Med， 2011， 51(10):1842-1848.

［ 4 ］ 李春晓.土家苗药夜关门功能的本草学相关研究［J］.中国中医药咨讯， 2011， 3(6):30-31.

［ 5 ］ 刘杰书， 李泳锋.补肝汤加夜关门治疗失眠 153 例［J］.中国民族医药杂志， 2009， 15(5):5-6.

［6］ 肖成荣，马增春，李海静，等.对氯苯丙氨酸失眠大鼠模型 的 制 作 及 其 机 制 ［ J］. 毒 理 学 杂 志， 2007， 21 (4):326.

［7］ 高希言， 马巧琳， 胡 斌.针刺 “四神聪” 对睡眠紊乱模型小鼠生理功能的影响［J］.中国针灸， 2007， 27(9): 681-683.

［8］ 全世建，刘洪涛，马 强，等.对氯苯丙氨酸大鼠失眠模型的症候属性研究［ J］.中医药学刊， 2006， 24(3): 450-451.

［ 9 ］ Ramanathan L， Siegel JM.Sleep deprivation under sustained hypoxia protects against oxidative stress［ J］ .Free Radic Biol Med， 2011， 51(10):1842-1848.

［10］ Gulec M， Ozkol H， Selvi Y， et al.Oxidative stress in patients with primary insomnia［ J］ .Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry， 2012， 37(2):247-251.

［11］ Hachul de Campos H， Brandão LC， D'Almeida V， et al.Sleep disturbances， oxidative stress and cardiovascular risk parameters in postmenopausalwomen complaining of insomnia［ J］ .Climacteric， 2006， 9(4):312-319.

R285.5

:B

:1001-1528(2014)02-0383-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.037

2013-09-18

郜红利 (1967—) ， 男 ( 土家族) ， 副教授， 研究方向: 民族药物 的开发与利用。 Tel:(0718)8437810， E-mail:349523825 @qq.com