诱导多能干细胞研究进展

宋卫华 刘坤 赵同标

（1.中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室，北京 100101；2.山东力明科技职业学院，济南 250116）

早期人们普遍认为哺乳动物细胞生长发育是一个单向、不可逆过程。随着分化的进行，发育潜力会逐渐丧失。人类的这一过程起始于精卵结合，终止于220 余种末端成熟分化细胞类型的建立［1］。20世纪30 年代，德国胚胎学家Spemann［2］对这一过程提出猜想——分化的动物细胞是否能像植物体细胞一样依然具有发育全能性，通过对蝾螈受精卵细胞核在时间与空间的隔离与重新分配，证明初级分化的动物细胞能发育成完整的动物。1952 年，著名发育生物学家Briggs 和 King［3］通过囊胚期细胞核移植试验证明早期分化细胞的细胞核具有发育为完整个体的能力。1958 年，Gurdon 等［4，5］利用成熟的体细胞——爪蟾肠上皮细胞成功获得健康的爪蟾个体，在证明动物完全分化细胞具有全能性的同时，使动物细胞发育理论获得了新的飞跃。1997 年克隆羊多利的诞生，则作为里程碑事件表明，高等哺乳动物的末端分化细胞亦具有全能性。迄今，人们利用这一理论已成功克隆小鼠、大鼠、狗、牛、羊、猪、猫等多种哺乳动物。最近，《细胞》杂志报道了通过体细胞核移植建立人胚胎干细胞的研究，使得动物体细胞全能性这一理论拓展到了高度进化的人类，为人类治疗性克隆提供了新的候选方案［6］。

核移植能够实现细胞重编程，但是对技术要求高，因而制约了其在遗传发育和生化研究的推广应用。为此，Stevens 等［7］和Kleinsmith 等［8］建立了来源于畸胎瘤和生殖细胞瘤、具有永生能力的多能性细胞系——胚胎癌细胞（Embryonal carcinoma cells，ECCs）。ECCs 可在体外传代培养并维持多能性状态。Miller 等［9］将ECCs 与体细胞（胸腺细胞）进行融合，融合后的杂合细胞具有了ECCs 特性，而丧失了体细胞的特性，表明ECCs 能够使细胞发生重编程，进而获得多能性。由于ECCs 细胞是一类肿瘤细胞，不但染色体数目和形态均发生变异，而且分化能力局限，所以后续很少被用来进行重编程研究。取而代之，Tada 等［10］将具有全能性的小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）与小鼠胸腺细胞进行了融合，并检测异核体分化能力，发现其具有形成3 个胚层的能力，与ESCs 相似。这一结果表明，ESCs 中存在能够将体细胞进行重编程的物质，使体细胞获得多能性。

体细胞核移植和细胞融合技术的发明极大地促进了细胞重编程机理的研究。科学家继而开始思考：ESCs 或者卵细胞中究竟是什么分子使得分化细胞的命运发生了逆转。1987 年，Davis 等［11］发现使用带有MyoD 基因的逆转录病毒感染成纤维细胞可将其转化成肌纤维细胞。这提示通过在某种体细胞中过表达关键性转录激活因子能够改变细胞命运，从而实现细胞类型的转变。随后，科学家陆续鉴定出细胞中多种调控细胞命运的关键转录激活因子，并尝试通过这些因子实现细胞重编程［12，13］。直到2006 年，Yamanaka 研究小组通过筛选ESCs 中特异性表达转录激活因子，鉴定出Oct3/4、Sox2、c-Myc 和Klf4 能够成功将小鼠成纤维细胞重编程到多能性状态，并命名诱导得到的细胞为诱导多能性干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）［14］。在iPSCs 建立之初，其是否与ESCs 具有类似的发育潜能一直是科学家们争论的问题［15］。四倍体补偿实验获得的完全iPSCs来源的小鼠无可辩驳的证明iPSCs 同ESCs 一样具有发育成小鼠的全能性［16-18］。2007 年，Yamanaka 研究团队和美国Thomson 研究小组分别成功建立人的iPSCs［19，20］，为重编程技术应用于临床带来曙光。

基于iPSCs 在基础理论研究的革命性突破和再生医学应用的重大潜在价值，iPSCs 的研究迅速成为干细胞乃至生物医学研究领域的前沿热点。最近的研究工作不仅在重编程方法及机理的认识上有了新的观点，而且在人类疾病模型及药物筛选等领域均取得了重要进展。

1 iPSCs 的诱导方法

自iPSCs 建立以来，重编程技术发展迅速。早期iPSCs 系的建立借助于病毒介导的重编程因子转染［14，19］。病毒介导的方法是细胞重编程机理研究的常见手段，最初的逆转录病毒仅能感染分裂旺盛细胞，因而诱导效率一直不高［21］。为此，Maherali 等［22］使用可诱导型慢病毒进行iPSCs 诱导，使诱导效率提高了100 倍以上。尽管病毒诱导能够快速、稳定的获得iPSCs，但病毒基因整合到宿主基因组内的持续表达会使细胞内源的部分因子不能被激活［23，24］。此外，病毒基因和活性物质在iPSCs 内的残留会干扰其发育潜力，还会导致嵌合动物中出现肿瘤［21］。

随后，科学家们致力于非整合重编程技术的研究。迄今为止，这一技术成功建立，不仅大大提高了重编程的安全性，还为诱导多能干细胞技术向临床应用奠定了坚实的基础。普通载体、附加体载体及腺病毒载体介导的转染技术能够成功建立小鼠及人的非整合iPSCs，但这种诱导方案存在效率低及筛选工作繁杂等缺陷［25-27］。重编程因子蛋白质的直接转染技术有望解决基因操作技术的工作量大及繁杂的缺陷，但其极低的诱导效率而使其难以普及应用［28-30］。基于重编程因子RNA 转染技术亦能够成功建立非整合iPSCs，目前该技术的普及仍受制于RNA 转染引起的免疫反应等复杂的技术困扰。值得一提的是微小RNA（microRNA）转染技术亦被证明能够建立人的非整合iPSCs［31，32］。2009 年，Judson等发现使用存在于ESCs 时期，与维持多能性相关［33-35］的microRNAs 与4 种转录因子共表达可增强iPSCs 的重编程效率［36］。Anokye-Danso 等［31］进一步发现，仅使用microRNA 也可以实现iPSCs 的诱导。使用非整合方法诱导iPSCs 的效率通常远远低于病毒载体介导的重编程技术。为解决这一难题，科研人员做了大量的探索。通过在非整合重编程技术诱导过程中添加小分子化合物等方案，使得获得非整合iPSCs 细胞系的工作越来越容易实现［28，35，37-42］。

新近一项振奋人心的工作发现：在诱导培养基中仅加入7 种小分子化合物FSK、VPA、CHIR、616452、Tranyl、DZNep 和TTNPB，能够成功的将小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs。在小分子诱导系统中，重编程细胞首先激活两个多能性相关的基因——Sall4 和Sox2，接着胚外内胚层基因Gata6、Gata4 和Sox17 等会随着表达，进一步使用Oct4 启动子驱动的荧光素报告基因研究发现，过表达Sall4 和Sox2能够激活Oct4 的表达，揭示Sall4 介导的分子信号通路在小分子重编程早期发挥作用。此外，Gata6、Gata4 等胚外内胚层基因在重编程过程中的上调，预示着胚胎发育调节基因也参与重编程过程，并且可能为细胞命运决定带来新的研究热点。更为有意思的是小分子来源的iPSCs 嵌合鼠存活率达100%，并且都能够健康生长6 个月以上，极大地避免了嵌合鼠中致畸、致瘤的风险。这暗示小分子来源的iPSCs更容易整合到发育过程中，或许为再生医学的临床应用提供新的选择。这项研究不仅避免了重编程中繁杂的基因操作的烦恼，而且证明了仅通过改变细胞内的关键信号通路能够决定细胞命运［43］。

2 iPSCs 重编程机理

与使用关键转录因子对体细胞进行细胞类型间转换的诱导相比，iPSCs 的诱导过程低效、缓慢。Xie 等［12］使用C/EBPα 诱导B 细胞向巨噬细胞的转化发现，体细胞类型转化的诱导过程仅需48 h，且转化率达100%。这表明使用转录因子进行iPSCs 诱导比诱导不同体细胞类型间转换所经历的阻碍多，可能是体细胞间的表观差异同体细胞和iPSCs 之间的表观差异程度不同所致。在重编程过程中，体细胞要经历DNA 去甲基化、组蛋白去乙酰化、染色体结构调整、多能基因激活，基因组印记去除等一系列复杂生物学过程。为明确体细胞重编程过程中的主要分子事件，Polo 等［44］对iPSCs 诱导过程中所经历的转录谱进行检测发现，体细胞重编程需要经历两个转录高峰期，第一波转录高峰由c-Myc/Klf4驱动，大概只有5%-10%的细胞可以发生第一波转录激活，激活的细胞Thy1、Snai1 和Cdkn2b 表达下调，SSEA1、Alp1 和Cdh1 表达上调，细胞组蛋白修饰、mRNA、microRNA 表达改变。经历第一波转录高峰的细胞仅有很少一部分能起始由Oct4/Sox2/Klf4驱动的第二轮转录高峰，进而细胞类型发生转换，成为具有多能性的细胞。此外，研究还提到，经历第一波转录高峰的细胞处于二价体状态，倘若使用四因子进行再次诱导，其还可以转换成为多能性细胞。这一研究表明重编程过程并非是一个连续的非可逆过程，处于重编程中间状态的细胞具备转换成完全重编程细胞的能力，并且不会由于发生重编程起始而导致细胞阻滞到特定时期。Polo 等所提到的重编程过程的两个转录波是细胞重编程的群体效应。Buganim 等［45］则对单细胞的重编程过程进行检测，也得到类似的结论。Takikawa 等［46］在此基础上研究了重编程中的基因印迹情况发现，小鼠iPSCs 产生过程中Snrpn 和Peg3 印迹区域的甲基化会消失，而且，双亲起始特异性表达的Snrpn 和Zim1 基因印迹也会消失，并在某些iPSCs 中还存在一条到多条染色体印迹区的无甲基化，为iPSCs 重编程中基因印迹的研究带来新发现。

体细胞重编程过程还伴随着复杂的细胞状态转换，Liu 等［47］使用顺序诱导的方法（iPSCs 诱导时，首先引入Oct4/Klf4，然后c-Myc，最后Sox2）研究了重编程过程中细胞状态转换，发现诱导之初，细胞首先会激活一个早期的由上皮型向间充质型的转换阶段（Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），此时，Slug 和N-cadherin 会发生上调；接着会出现一个延迟的间充质型向上皮型的转变（Mesenchymalto-epithelial transition，MET）。如果在早期EMT 发生时使用TGF-β 处理细胞1.5 d，就能够提高重编程效率，而处理12 d 则会阻滞重编程的进行。这表明在重编程过程的早期EMT-MET 对于重编程的起始起关键作用。Bedzhov 等［48］进一步研究了细胞类型转换中起主要作用的黏附因子对于iPSCs 多能性建立和维持所发挥的作用。他们使用单基因替代的基因敲入方法将N-cadherin（N-cad）或E-cadherin（E-cad）/N-cad 嵌合钙黏着素整合到E-cad 基因位点发现，经敲入的ESCs 都能维持未分化状态，维持Nanog 等多能性基因的表达，且够在体内外实现完全分化；进一步将E-cad 敲除则发现ESCs 丢失了上述特性。因此，E-cad 介导的细胞黏着是iPSCs 产生所必须，且试验证实E-cad 敲除的成纤维细胞不能重编程。而N-cad 与E-cad 相似，有效地促进了细胞重编程，对于MET 转换起始发挥关键作用。这一结果丰富了E-cad 与多能性相关，N-cad 与分化相关的结论。

尽管ESCs 和iPSCs 在自我更新和发育多能性方面较接近，但有科学家提出iPSCs 与ESCs 在基因表达和分化能力上并非完全一致［49］。研究发现，虽然iPSCs 和ESCs 在细胞表面标记蛋白的表达上相同，且能产生畸胎瘤，但其发育潜力存在细微的差异［14，50，51］。2008 年，Mikkelsen 等［24］发现完全 重编程的细胞在基因表达和表观状态上更接近ESCs，而部分重编程细胞则在干细胞相关基因的表达上存在抑制。2010 年，Stadtfeld 等和liu 等［52，53］发现位于第12 号染色体的qF1 位置的Dlk-Dio3 基因族的沉默，会引起不完全重编程的发生。2011 年，Mattout等［54］对小鼠iPSCs 重编程过程中组蛋白（H3ac、H4ac、H4K5ac、H3K9ac、H3K27ac、H3K4me3、H3K36me2、H3K9me3、H3K27me3 和γH2AX） 修饰变化检测发现，完全重编程细胞在组蛋白水平与ESCs 相似，而部分重编程细胞则存在显著差异。2013 年，Razak 等［55］从miRNA 水平分析人的ESCs和iPSCs 发现，iPSCs 在19 号染色体miRNA 簇的表达明显高于ESCs，表明了iPSCs 与ESCs 间的差异，然而造成这一差异的调控机理还不清楚。此外，不同方法诱导产生的iPSCs 之间也存在差异，因而是否存在与生理条件来源ESC 完全一致的细胞系，或如何优化重编程条件获得同生理条件来源完全一致的iPSCs 是尚未回答的科学问题。

另外，近年的研究工作使人们对细胞重编程机理有了新的认识。研究发现，将核小体重构和去乙酰化抑制复合物中的核心成员Mbd3/NuRD 敲除的细胞进行iPSCs 诱导，几乎所有的体细胞都能重编程为iPSCs，这挑战了传统对于重编程过程的认识。这项研究还揭示了4 种重编程因子在重编程过程中的双重作用：激活内源多能性网络的同时，直接刺激细胞募集Mbd3/NuRD 复合物进而抑制4 种因子下游靶基因的激活。这使4 种因子在重编程过程的抑制作用受到重视，也揭示出转录因子介导的重编程过程并非都是促进细胞分化［56］。另有研究表明，胚胎发育时期的特定基因对细胞重编程过程也发挥作用，研究人员通过试验证实核心转录因子中的Oct4 和Sox2 能够被中胚层和外胚层的标记基因所替代，并提出“跷跷板模型”解释了胚胎发育与细胞重编程的关系。这些研究表明iPSCs 的产生过程并非完全是一个发育分化的逆过程，不同胚层发育之间的竞争很可能贡献于iPSCs 多能性的获得，这在一定程度上解释了重编程效率极低的原因［57］。

3 iPSCs 临床研究

iPSCs 的临床研究主要集中在疾病模型和细胞治疗两个方面。

许多退行性疾病如I 型糖尿病、老年痴呆症和帕金森综合症等是临床的疑难病症，发病分子机理还远未清楚，同时传统的药物及手术等治疗很难治愈。基于干细胞技术的细胞替代治疗被认为是最有希望治疗这些疾病的手段。理论上讲，患病个体来源的iPSCs 不仅能够为体外研究疾病发生的分子机理提供革命性的工具，其体外分化的相应细胞组织还可为细胞替代修复病变组织提供可能，而且，这些iPSCs 分化来的相应细胞组织能为体外筛选有效药物提供新的平台。美国的Chae 研究小组建立了研究亨廷顿氏病病人特异的iPSCs，并与正常人的iPSCs 进行蛋白组学比较，发现未分化阶段的两种iPSCs 存在26 种蛋白表达差异，而这些蛋白与氧化应激、细胞凋亡以及细胞氧化代谢相关，进一步研究发现SOD1 和Prx 家族蛋白主要影响病人来源的iPSCs，进而导致其细胞对氧化应激的敏感［58］。这一模型的建立极大地推动了疾病特异药物的开发和疾病机理的研究。目前，许多退行性疾病如帕金森综合症［59］、肌萎缩性脊髓侧索硬化症［60］、阿尔茨海默病［61］等的iPSCs 纷纷建立，这极大地促进了针对个体疾病的发病机理和新药研发，亦为未来针对病人个体的细胞替代治疗奠定了基础。体外获得的iPSCs 极大地便利了科研人员对疾病的研究，但是体外培养还存在与体内环境的较大差异。2013 年，Lancaster 等［62］利用三维培养技术，将人的ESCs 诱导分化成为大脑皮层组织，并且使用前、中、后脑特定的标记蛋白检测了三维培养得到的大脑组织，确定了分化的大脑组织的功能区域形成。他们还通过RNA 干扰技术将病人来源的iPSCs 构建成为小头畸形的疾病模型，为研究更为复杂的组织病变提供了借鉴。

在细胞治疗方面，由于人体之间存在个体差异，因而使用异体器官移植极易引起免疫排斥反应，需要服用抑制机体免疫的药物进行维持，但药物本身所带来的副作用对身体的伤害是不可想象的。此外，异体器官移植需要找到合适的供体，而现今捐献器官的人数有限，也使得异体器官移植受到很大程度的限制。为此，如果使用个体特异的成体细胞诱导成为iPSCs，则可以解决上述一系列问题，还可以通过同源重组来修复导致疾病的基因突变。早在2007年，这一想法已经在镰刀形贫血症小鼠模型上证明是可行的［63］。之后，Yan 等［64］将小鼠iPSCs 自体移植到心肌梗塞的小鼠体内发现，移植后的iPSCs能够形成血管平滑肌细胞和内皮细胞，并且对于心脏功能有所改善，进而证明iPSCs 进行细胞治疗可以应用到疾病模型的治疗。为了更好地模拟iPSC 在治疗人类疾病中的作用，2013 年，Morizane 等［65］将灵长类iPSCs 来源的神经细胞进行自体和异体移植发现，自体移植的iPSCs 来源的神经细胞几乎不会引起免疫排斥反应，并且体内存活细胞数目多，而异体移植的iPSCs 则会引起体内的获得性免疫反应，激活体内的小神经胶质细胞（BA-1+/MHC class II+），并且有白细胞（CD45+/CD3+）浸润。这一发现极大地鼓舞了iPSCs 在移植治疗的中应用，并且为iPSCs 应用于人类疾病奠定了重要的理论依据。近期，Schwartz 等［66］研究人员使用人ESCs 来源的视网膜色素细胞进行移植治疗退行性黄斑病变，经过一段时间的观察发现，病人的视觉感知能力有所提升。这一探究为临床应用iPSC 技术提供了很好的范例。

4 展望

尽管iPSC 研究仍是一个相对年轻的领域，但自发现以来领域内不断取得重大研究进展。随着对重编程分子机理认识的加深，重编程方法的改进，更多的研究致力于将iPSC 技术应用于临床。在重大退行性疑难疾病、单基因遗传病等的疾病模型及药物筛选等领域iPSC 越来越显示出其强大的优势。iPSC技术在小鼠镰刀形贫血症等疾病治疗中的成功运用为临床应用iPSC 技术治疗人类疾病带来了希望。

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