细菌异源表达抗菌肽的研究进展

吕晓萌 胡彤 俞婷 崔艳华

抗菌肽最早发现于惜古比天蚕蛹中，随着研究的深入，人们在动植物、微生物及人体内都发现了抗菌肽的存在。目前为止已有上百种抗菌肽的结构被测定。抗菌肽分子量一般较小，含有20-60个氨基酸残基，呈现明显的阳离子特性，具有两亲性，在较高、较低的pH值条件下都有较强的活性，且较强的热稳定性［1］。获得抗菌肽一般通过3种途径：分离纯化天然抗菌肽、化学合成和基因工程技术生产抗菌肽。天然存在的抗菌肽通常产量低，无法大量提取；化学合成费用昂贵。因此基因工程技术是目前一种较有效获得抗菌肽的方法［2］。目前多种抗菌肽已在细菌、酵母、植物等系统中成功重组表达。本文着重阐述抗菌肽在大肠杆菌、乳酸菌中重组表达的研究进展。

1 抗菌肽在大肠杆菌中的表达

大肠杆菌由于其生长速度快、遗传背景清晰、有大量可利用的商业表达载体、易操作、费用相对低，对蛋白质的耐受力强等［2］优点而备受研究者的青睐，尤其是其特有的多种质粒、重组融合伴侣以及突变菌株更增强其成为宿主的可能性［3］。因此成为抗菌肽表达的首选宿主。

1.1 表达策略

1.1.1 密码子偏爱性改造 由于大肠杆菌基因组缺乏识别某些密码子的tRNA，导致大肠杆菌对密码子的使用有相当程度的偏爱性，同一密码子家族只有很少密码子被反复使用。因此来自真核生物基因的表达会受到影响。通常可以将密码子设计成宿主偏爱的密码子序列可以提高表达水平。Li等［4］将人β-防御素基因在大肠杆菌中表达时的密码子改造为大肠杆菌偏爱的基因，从而获得高效融合表达，融合蛋白占细菌总蛋白的50％以上，是野生型基因表达量的9倍。除改造外源基因外，也可以选择合适的表达菌株。Rosetta系列宿主菌是BL21衍生菌，其可以补充密码子CCC、AUA及GGA的tRNAs，从而克服了大肠杆菌的偏好性对外源基因表达的影响［5］。

研究者研究了人体防御素-5（HBD5）和防御素-6（HBD6）在大肠杆菌中的重组表达。防御素-5和防御素-6基因进行了密码子优化，每个基因分别与一个硫氧还蛋白A构建成表达载体，转化到Escherichia coli BL21（DE3）菌株并且在MBL培养基中培养，结果得到高体积产率的HBD5和HBD6融合蛋白，分别为1.49g/L和1.57g/L。纯HBD5和HBD6的回收率分别为38％和35％。两种表达蛋白对大肠杆菌均有抗菌活性［6］。

Wang等［7］首次提出通过基因工程的方法将人类α-防御素 6（HD6）在大肠杆菌中高效生产。HD6主要在人体消化道内的上皮细胞中表达，在黏膜免疫中发挥重要作用。编码成熟HD6的mHD6序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行了优化。将优化后的序列omHD6克隆到表达载体pET32a（+）上，该表达载体含有硫氧还蛋白（TrxA）。在这种优化表达的情况下，融合蛋白TrxA-omHD6可溶性较高（＞60％），产量大约为1.69g/L，重组mHD6（rmHD6）的理论产量大约为0.38g/L。经过一系列分离纯化rmHD6，体外试验表明，rmHD6对单纯的疱疹病毒-2具有较强的抑菌作用。

Wang等［8］根据大肠杆菌密码子的偏好性合成了buforin II的模拟物buforin IIb，将其克隆到载体pET32a中，获得了重组质粒pET32a-buforinIIb。转化大肠杆菌，获得了重组buforin IIb。经纯化后得到纯度＞99％的活力为3.1mg/L的重组buforin IIb，其活力与化学合成的buforin IIb相似。

1.1.2 串联表达 由于抗菌肽的分子量较小，对其表达纯化等都会造成一定的负面影响，因此为了解决这一问题，从源头上提高蛋白质的产量，人们采用了基因多拷贝同向串联融合表达的策略。例如，成熟的人体内的抗菌肽β-防御素-2在串联表达的情况下，产量提高 6倍［9］。2007年，沈益等［10］将天然肿瘤坏死因子TNFa的3'端与抗菌肽cecropin-Xm基因串联在一起，在菌株BL21中诱导融合表达，融合蛋白经纯化后用CNBr（Cianogen Bromide）切割，体外活性试验显示其具有抗菌性及抗肿瘤活性。同时此策略也有效地避免抗菌肽对宿主菌的毒性。

预测水源地持续20年后水位下降值和5年、10年相近(图3)，观测井受水源地影响较小(下降值0.11～0.25 m)。预测地下水位在初期将可能伴随急剧下降，经过地下水的调蓄，在3～4年里，水源地运行相对稳定。

Rao等［11］设计了肽抗生素hPAB-beta的串联重复多聚体，并且分别构建了含有1-8个拷贝hPAB-beta基因的重组质粒。含有重组pQE-hPAB-beta 1-8重组体的8个基因工程菌能够分别以包涵体形式表达hPAB-beta多聚体，蛋白表达量达到总蛋白量的2.6％-28％。hPAB-beta 三聚体具有较高的表达水平（27.8％），细胞湿重产量达到3.15±0.45g/L。融合蛋白包涵体溶解于8mol/L的尿素中，经过纯化后，获得重组hPAB-beta对微生物临床菌株的最小抑菌浓度为31-250mg/mL，结果证明重组hPAB-beta保持了其生物活性。

1.1.3 融合表达 抗菌肽的表达会遇到两个挑战：一是由于其分子量小及高阳离子特性，对蛋白酶敏感，易被宿主菌中的蛋白酶降解；二是抗菌肽的抗菌特性对宿主细胞具有潜在的杀伤力［12］。为了避免上述情况的发生，一般采用以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达抗菌肽基因，即在抗菌肽的N端连接一段蛋白质序列，这样表达出的融合蛋白对宿主细胞无影响且提高了表达水平，最后目标抗菌肽可以通过酶学或化学的裂解剂在融合位点释放出来［13］。

载体蛋白通常分为两类：（1）一类是提升溶解性的载体蛋白如谷胱甘肽转移酶（Glutathione S-transferase，GST）、 硫 氧 还 蛋 白（Thioredoxin，Trx）、小泛素修饰物（Small ubiquitinlike modifier，SUMO）等。其中麦芽糖结合蛋白（MBP）和N-利用物A（NusA）也被用作载体，尤其是在易形成包涵体的蛋白质中［2，3］。硫氧还蛋白是当前抗菌肽表达中应用最为广泛的载体蛋白，占已报道融合表达的抗菌肽的20％以上，成功表达了Cecropin CM-4、β-防 御 素 3、Hinnavin II、Indolicidin、Lactoferricin和 Perinerin 等不同来源的抗菌肽［2，3，12］。硫氧还蛋白作为二硫键还原酶，可以有效地催化二硫键在大肠杆菌细胞质中形成，同时其也显现出类似分子伴侣的活性。以上特性利于二硫键的形成和抗菌肽的正确折叠。SUMO是一种与泛素结构相关但功能不同的小蛋白，约由100个氨基酸组成。SUMO表面亲水性，内部呈现疏水性，因此其具有高度可溶性。作为融合蛋白伴侣，SUMO可以有效改善目标蛋白的折叠、可溶性及表达量。在体外用SUMO蛋白酶合理的去除SUMO标签可以方便带有N末端的目标蛋白的产生。由于其在真核生物中的生理相关性，因此SUMO可以作为一种合适的在真核生物原核生物中提高蛋白表达的生物技术工具［14］。近年SUMO已经成功用于 Brazzein、Exendin-4、hEGF、Urodilatin、Cecropin CM-4和β-防御素4等抗菌肽的表达［2，12］。（2）另一类是促进聚合的载体蛋白以加速融合蛋白包涵体的形成，如PurF片段、甾酮异构酶（Ketosteroid isomerase）、TAF12组蛋白折叠域、类固醇异构酶及PAP3.30等［13］。此类载体蛋白利用是基于不溶表达可有效的防护抗菌肽对宿主细胞的毒害，并且保护其免受宿主蛋白酶的降解的认识。该类融合表达蛋白利于快速纯化，并且不含半胱氨酸的抗菌肽不需要复性。

1.1.4 杂合表达 将来源不同的抗菌肽进行杂合表达是当今抗菌肽表达研究的热点之一。最初杂合抗菌肽由化学合成的方法获得［15］。最早杂合抗菌肽的1-11氨基酸来自cecropin A，12-37氨基酸来自cecropin D，结果显示其抗菌活性是cecropin D的5-55倍［15］。这一结果，给研究者很大的启发。近年来研究者成功在大肠杆菌中表达了一系列不同来源的杂合抗菌肽，如 CA-MA、hin/MSH 和 LFT33等［16-18］。研究者将家蝇的泛素序列克隆到质粒pQE30中，构建载体pQEUBI。而后将大肠杆菌偏爱的密码子合成编 码 CA-MA［cecropinA（1-8）-magainin2（1-12）］的cDNA片段，克隆到载体pQEUBI中，杂合抗菌肽CA-MA与泛素融合表达。融合蛋白以可溶性形式高效表达，占总蛋白的36％。融合蛋白切除泛素后，产生的 CA-MA具有较高抗菌活性［16］。

编码hinnavin II/α-黑色素细胞刺激素杂合肽hin/MSH克隆到pET32a（+）。杂合肽在大肠杆菌BL21中以融合蛋白形式表达，50％的重组蛋白以可溶形式表达，切除Trx-hin/MSH后，具有广谱的抗菌活性［17］。

与亲本相比，现已表达的杂合抗菌肽均显示了更为广谱的抗菌能力和更强的抗菌活性。新型杂合抗菌肽LFT33 由源于牛乳铁蛋白N端的LfcinB 和昆虫抗真菌肽thanatin衍生而来。LfcinB和thanatin均具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌和阴性菌及真菌具有抑制作用。LFT33整合了LfcinB的1-15氨基酸和thanatin的4-21氨基酸。其cDNA片段以大肠杆菌偏好性密码子进行化学合成，并构建到pET32a（+）载体上，成功在大肠杆菌中融合表达［18］。

1.2 抗菌肽在大肠杆菌中的表达

目前，研究者已经利用大肠杆菌为宿主，表达了大量不同来源的抗菌肽。谢芳等［19］利用pGEX-3X作为载体，将牛蛙皮肤抗菌肽ranalexin基因插入载体中，建立表达载体，将表达条件优化至IPTG终浓度为1.0mmol/L、诱导时间为5-6h，并确定其对金黄色葡萄球菌有显著的体外抑制作用。韩宗玺等［20］将鸡舌组织中的Gal-9基因与大肠杆菌表达载体结合后再转化大肠杆菌BL21，37℃培养后发现重组蛋白占菌体总蛋白的40％，且经纯化后的重组蛋白对生长中期的大肠杆菌和致病性链球菌均有抑制作用。Tapia等［21］将杂合基因编码为Ap-S后转录到大肠杆菌BL21中，纯化后的重组Ap-S被用于抗真菌剂，在菌丝结构中其具有很强的抑制活体营养型和死体营养型真菌的活性。这项技术可以用于农业生产中。Wu等［22］将杂合肽MVF-EGFR237-267编码序列分别克隆到pET-21b和pET-32a中，单独表达或者与硫氧还蛋白、His6-tag形成融合蛋白的形式表达。结果发现单独形式无法表达，而融合形式可过量表达。这种重组的杂合肽产量较高，且可用于针对二聚表皮生长因子受体的治疗性抗菌肽疫苗。

2 抗菌肽在乳酸菌中的表达

乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生乳酸的细菌的总称，广泛应用于酸奶、泡菜及其他发酵食品的生产。部分乳酸菌存在于人类体内具有促进营养物质吸收，改善人胃肠道功能；抑制有害细菌的产生，调节免疫系统等益生功效［23］。乳酸菌作为世界公认安全（Generally recognized as safe，GRAS）的食品级微生物，与大肠杆菌相比，其更具直接应用于食品及临床领域的潜力［24］。除此以外，将乳酸菌替代大肠杆菌作为基因工程的宿主菌具有很多其他优势，如乳酸菌具有高度可调控的启动子系统，在细胞内外均可表达外源基因并能将其分泌到胞外培养基中［25］。Christiaens等［26］证实了乳酸菌的染色体组经改造后几乎不分泌蛋白，适合外源基因的表达。

2.1 乳酸菌的表达系统

2.1.1 表达宿主 乳酸乳球菌是当前应用最为广泛的乳酸菌重组表达宿主。作为乳酸菌的模式菌，该菌是最早完成全基因组测序的乳酸菌［27］。当前已经完成多株乳酸乳球菌的全基因组测序，其中包括当前常用的宿主菌株Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363和NZ9000。上述乳酸菌全基因组序列的解析，为在全基因组水平，获得该菌基因转录、代谢调控信息；明确其遗传背景；构建适宜载体、提高外源基因表达效率，奠定了基础。分子遗传操作工具相对完善，使得乳酸乳球菌广泛用于外源基因的表达。当前已有大量外源基因，其中包括Acidocin A、Enterocin A、Lactacin F和Pediocin PA-1等多种抗菌肽基因在乳酸乳球菌中成功表达［24，28］。

植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）［29-33］、沙克乳杆菌（Lactobacillus sakei）［31-33］、冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）［33］、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）［32］和约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）［32］等也被用作外源基因的表达载体。

2.1.2 表达系统 表达系统依据启动子的不同可分为组成型表达系统和诱导型表达系统。表达载体pMG36e是组成型表达的代表，其具有强启动子p32，以及来自广宿主乳球菌质粒pWV01的复制子［34］。该质粒大小适中，为3.6 kb，便于遗传操作；且具有红霉素抗性，利于筛选。抗菌肽enterocin P［35］、enterocin A［36］、Sakacin A［37］等由 pMG36e 的衍生质粒pMG36c在乳酸乳球菌中均成功表达，可以有效抑制李斯特菌。

组成型表达系统中，连续的高产量表达会导致细胞内蛋白质的积累、聚集，对细胞产生毒害。因此一般选择诱导型表达系统。其中Nisin调控的表达系统（Nisin-controlled gene expression system，NICE）是最为常用的诱导型表达系统。NICE系统是基于抗菌肽nisin生物合成的自我调节机制而建立，该系统具有精细调控和高度诱导能力，是当今最为成熟的乳酸菌表达系统［38］。在NICE系统中，定位于细胞膜上组氨酸蛋白激酶NisK感知诱导信号nisin，并且发生自我磷酸化，接着将磷酸基团转移到细胞内的应答调节蛋白NisR，后者激活nisA启动子，进而下游基因表达。NICE系统可以通过Lactobacillus、Streptococcus、Enterococcus、Bacillus、Leuconostoc lactis和Lactobacillus helveticus等革兰氏阳性菌过量表达蛋白，尤其是乳酸乳球菌L. lactis。

抗菌肽Apidaecin以与泛素融合的方式利用NICE系统成功表达，融合蛋白的产量高达宿主整个可溶性蛋白的7.2％；切除融合蛋白泛素后，表现出明显抗菌活性［39］。分离自Pediococcus acidilactici的IIa型抗菌肽pediocin PA-1对李斯特菌具有很强的抑菌能力。研究者利用NICE系统成功表达了具有抗菌活性的 pediocin PA-1［40］。Renye 等［41］利用nisin诱导表达载体pMSP3535H3，在Streptococcus thermophilus，L. lactis ssp. lactis 和 L. casei等 多 个乳酸菌宿主中表达了抗菌肽pediocin，均对Listeria monocytogenes Scott A具有明显抑菌活性。

双组分信号转导系统（Two-component regulatory system，TCS）普遍存在于革兰氏阳菌的抗菌肽的合成调控中。因此相继在沙克乳杆菌（L.sakei）［42］、 肠 球 菌（Enterococcus）［43］、 植 物 乳 酸菌（L. plantarum）［44］等乳酸菌中建立了类似NICE的表达系统。同时基于IIa类抗菌肽sakacin A或者sakacin P的启动子和调控基因建立了一系列表达载体pSIP［31，45］。除了NICE诱导型表达载体外，还有pH、乳糖、温度敏感型诱导系统等诱导表达系统。

2.1.3 信号肽 大多数由乳酸菌产生的抗菌肽，通过相应的ABC型转运系统和其辅助蛋白运输到细胞外。而许多分泌型的原核蛋白和少数的抗菌肽（如enterocin P、hiracinJM79）在N端具有所谓的Sec型信号肽。此类信号肽被信号肽酶所识别，并被切除。成熟蛋白或者肽通过一般分泌系统（General secretory pathway，GSP）或者 Sec-依赖型途径被运输到细胞外，最终导致成熟蛋白或者肽释放到细胞外。因此分泌蛋白N端的信号肽在外源表达中，可以引导融合的成熟蛋白或者肽进行分泌表达［46，47］。

为提高外源蛋白的分泌表达，利于蛋白分泌的信号肽被应用。当前，来自乳酸乳球菌MG1363主要胞外蛋白Usp45的信号肽被广泛应用，并显示较好的促进分泌表达的效果［48-50］。Usp45的信号肽由27个氨基酸组成，这27个前导肽残基序列揭示了信号肽的3重特征：拥有一个带正电的N末端；一个中央疏水核心及一个C末端裂解区域［48］。

Sec-依赖型的抗菌肽enterocin P、hiracin JM79的信号肽也被用于外源基因的分泌表达中，尤其是抗菌肽的分泌表达中。Usp45、enterocin P、hiracin JM79的信号肽SPusp45、SPentP和SPhirJM79分别与成熟的enterocin A和免疫蛋白EntiA融合，被克隆在表达载体pNZ8048和 pMSP3545（诱导型启动子PnisA）和pMG36c（组成型启动子P32）上，转 化 到 Lactococcus lactis、Enterococcus faecium、E.faecalis、L. sakei和P. acidilactici等不同乳酸菌中。研究发现enterocinA的表达量、抗菌活性和特异抗菌活性依信号肽、表达载体、宿主不同而存在差异。其中重组L. lactis NZ9000（pNZUAI）和L. lactis NZ9000（pNZHAI）的上清中过量表达的enterocin A，对不同的李斯特菌的抗菌活性是enterocin A原始分泌菌株E. faecium T136的1.2-5.1倍［51］。可见，信号肽的添加促进了外源抗菌肽的分泌表达。

2.2 抗菌肽在乳酸菌中的重组表达

周绪霞［52］通过对蜜蜂抗菌肽的结构分析，以乳酸乳球菌为表达载体，实现了蜜蜂抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表达。李朴等［53］采用PCR方法合成bactenecin7基因及其相关调控基因，克隆到载体pMG36e中，将重组质粒转化到乳酸菌中后发现该乳酸菌能分泌表达bactenecin7，并具有抑菌作用。

O’Keeffe等［54］将一段 10.5kb 含有 enterocin A生物合成的所有基因和调控区域的片段，克隆到大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭性载体pCI372中。携带重组质粒pENT03的E. faecalis OG1X转化子，在固体培养基中产生了enterocin A和其诱导因子。在液体培养基中，仅在加入外源的诱导因子后才发现enterocin A的合成。研究者推测这个结果是由于缺乏调节enterocin A合成的双组分调节系统表达。

为了获得更加广谱的抗菌能力，研究者尝试将多个不同抗菌肽在乳酸菌中共同表达，但是效果不尽理想。Martínez等［55］研究了在乳酸乳球菌IL1403中共同表达pediocin PA-1和enterocin A。携带有pediocin PA-1的结构基因和免疫基因的pMG36c和携带有enterocin A的结构基因和免疫基因的pHB04被共同转化到L. lactis IL1403中。获得转化子上清中的pediocin PA-1和enterocin A浓度较低，仅为野生型的4％和5％。因此，并不适合共同表达。II型抗菌肽Acidocin A分离自嗜酸乳杆菌TK9201，该菌为生产发酵乳的发酵剂［56］。决定Acidocin A生物合成的基因位于一个45kb的质粒pLA9201上。一段0.9kb包含Acidocin A结构和免疫的基因片段被克隆到大肠杆菌-乳酸菌穿梭性载体pULA105E中。将重组质粒转化到不产acidocin A的突变株TK9201-1中，未能产生Acidocin A。同样的研究，克隆pLA9201限制片段侧翼的acdA，表明结构基因的上游区域对acidocin A 合成是必要的［56］。

除了大肠杆菌和乳酸菌，其他细菌也被应用于抗菌肽的外源表达。革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌作为宿主，成功表达了天蚕素A和D杂合肽［57］。李丽等［58］将蜜蜂抗菌肽Abaecin基因插入表达载体pGplat，而后转化到枯草芽孢杆菌中以表达重组蛋白，结果表明表达蛋白对大肠杆菌及沙门氏菌均有抑制作用。也有研究表明费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）同样可以作为抗菌肽的表达宿主［58］。Brede 等［59］基于 P. freudenreichii中滚环复制且携带氯霉素抗性的pLME108质粒，构建了大肠杆菌和P. freudenreichii间的穿梭性载体；并利用此系统成功表达了来自Propionibacterium thoenii的抗菌肽基因。

3 小结

抗菌肽的重组表达涉及多种表达宿主，其中大肠杆菌因其易培养、费用低、操作方便等特点而成为抗菌肽在原核生物中表达的主要表达宿主。大肠杆菌表达中主要存在抗菌肽分子量小不利于纯化，且表达蛋白对宿主产生毒害等问题。在乳酸菌中的重组表达也较为广泛，且与大肠杆菌相比，更适合应用于食品领域，因此具有较大的研究与应用潜力。但目前对乳酸菌的遗传背景了解相对较少，表达系统并不十分完善，存在表达效率低和不稳定等问题。因此，建立高效表达、便于后期纯化的表达系统，仍是抗菌肽异源表达研究的重点。

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