食源性沙门氏菌耐药性及质粒介导喹诺酮耐药基因检测

刘贵深于涛

（1.潮州市质量计量监督检测所，潮州 521011；2.新乡学院，新乡 453000）

食源性沙门氏菌耐药性及质粒介导喹诺酮耐药基因检测

刘贵深1于涛2

（1.潮州市质量计量监督检测所，潮州 521011；2.新乡学院，新乡 453000）

随机采集的638份食品样品中沙门氏菌总检出率为9.7%（n=62株），共检出16种不同的血清型，其中最常见的为鸭沙门氏菌。受试菌株对磺胺甲基异噁唑、复方新诺明、链霉素和环丙沙星的耐药率较高。16株耐环丙沙星沙门氏菌按GyrA和ParC喹诺酮耐药决定区（QRDR）不同氨基酸替代组合可分为5种突变型，其中GyrA亚基发生Ser83Phe和Asp87Gly变异，同时ParC亚基发生Ser80Arg变异为最常见的突变类型。62株食源性沙门氏菌中，qnr基因阳性的菌株共7株，占受试菌株的11.3%。qnrA和qnrS基因阳性菌株分别有2株和5株，没有菌株携带qnrB、qnrC和qnrD基因。aac（6'）-Ib基因阳性菌株共有8株，其中3株经确认为携带其变体基因aac（6'）-Ib-cr。结果表明，新乡市食源性沙门氏菌血清型分布呈多样性，耐药状况较为严重，并且一些菌株携带质粒介导喹诺酮耐药（PMQR）基因。

食源性 沙门氏菌 耐药性 质粒介导 喹诺酮类

沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌。资料显示，中国70%-80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的，沙门氏菌作为食源性致病菌所引起的危害在不断扩大［1-3］。沙门氏菌的许多血清型，如肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，均可导致宿主产生腹泻等食源性疾病［4］。近年来，由于抗生素在农业、畜牧业和临床治疗中的广泛使用甚至是不遵守规则的滥用，导致沙门氏菌的耐药性问题日益严重［5，6］。喹诺酮类抗生素是由萘啶酸发展起来的全合成抗菌药物，具有独特的作用机制、优秀的药物动力学性能和抗菌活性等特性，已成为人类临床及动物疾病治疗和预防的常用药物。以往研究显示，沙门氏菌对喹诺酮类的耐药主要由喹诺酮耐药决定区（Quinolone resistance-determining region，QRDR） 的靶位改变和主动外排所致，两者均由染色体介导［7］。近期研究发现，质粒介导的喹诺酮耐药（Plasmidmediated quinolone resistance，PMQR）是其耐药性传播的主要途径［7］。现已报道的PMQR机制有3类，即qnr家族、aac（6'）-Ib-cr和喹诺酮类药物特异性外排泵qepA。然而，目前对沙门氏菌PMQR机制的研究多集中于人类临床分离株，对食源性沙门氏菌的报道较少。

细菌耐药菌株的传播和多重耐药菌株的出现是导致各类传染病治愈率受限制的主要原因之一［8］，且耐药菌株可以通过多种途径传播并经食物链进入人体。研究食源性沙门氏菌的药敏特征及耐药机制有助于从食物链的源头和食品性动物生产中采取合理的干预措施，从而减少和防止沙门氏菌耐药性的产生，保障食品安全。为此，本研究对新乡市4类食品样品中沙门氏菌的污染状况进行了调查，分析菌株的血清分布和耐药性；同时对食源性沙门氏菌的QRDR靶位突变以及PMQR的流行情况进行检测，旨在更好地了解食源性沙门氏菌对喹诺酮类药物产生耐药性的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 以新乡市农贸市场、超市、大卖场和部分副食品经营单位为对象，按照随机采样原则和食品微生物学检验采样的要求，共采集4类食品样品638份，其中生肉367份（包括猪肉、牛肉、鸡肉和羊肉），水产品73份，蔬菜98份，熟肉制品100份。

1.1.2 标准菌株 沙门氏菌标准菌株ATCC 50041、大肠杆菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853：中华人民共和国卫生部药品生物制品检定所。

1.1.3 培养基及主要试剂 培养基，北京陆桥生物技术有限公司；生化鉴定试剂条，法国梅里埃公司；沙门氏诊断血清，泰国A&S公司；药敏纸片，北京天坛药物生物技术开发公司；用于PCR扩增的试剂，大连宝生物工程有限公司；扩增引物，上海英骏生物技术有限公司。

1.1.4 仪器与设备 JC303型电热隔水式培养箱，上海嘉程仪器设备厂；ATS-032型空气浴摇床，上海堪鑫仪器设备有限公司；BagMixer lab blender 400均质器，法国Interscience公司；基因扩增仪，北京东胜创新生物科技有限公司；电泳仪，北京市六一仪器厂；凝胶成像分析系统，北京炳洋科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品中沙门氏菌的分离鉴定 按照GB 4789.4-2010规定的方法对样品进行沙门氏菌的分离与鉴定。试验过程以沙门氏菌标准菌株ATCC 50041作为阳性对照。

1.2.2 药敏试验 按照WHO推荐的K-B琼脂纸片扩散法进行，结果判定依照美国临床实验室标准委员会（CLSI）2010版方法手册进行。每批试验均用大肠杆菌ATCC 25922铜绿假单胞菌ATCC 27853进行质量控制。

1.2.3 DNA模板的制备 采用煮沸法提取细菌DNA作为PCR反应的模板。

1.2.4 PCR扩增 DNA促旋酶和拓扑异构酶IVgyrA、gyrB、parC和parE基因的引物设计参照文献［1］，引物序列见表1。PCR产物经回收纯化后送至上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列双向测定。所测序列采用DNA star软件进行序列拼接和氨基酸序列的推导，并应用BLAST软件将测序结果与GenBank数据库进行同源性分析比对。

1.2.5 PCR扩增PMQR基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS和aac（6'）-Ib基因的引物设计参照文献［9-11］，引物序列见表1。

2 结果

2.1 食品样品中沙门氏菌的分离情况

638份样品中共检出沙门氏菌62株，总检出率为9.7%（表2）。367份生肉样品中检出沙门氏菌46株，检出率达12.5%；73份水产品中检出沙门氏菌5株，检出率为6.8%；98份蔬菜样品中检出沙门氏菌2株，检出率为2.0%；100份熟肉制品中检出沙门氏菌9株，检出率为9.0%。

2.2 食品样品中沙门氏菌的血清型分布

62株沙门氏菌中共检出16个不同的血清型（表3），其中较为常见的有鸭沙门氏菌（22.6%）、山夫登堡沙门氏菌（17.7%）、德尔卑沙门氏菌（12.9%）和肠炎沙门氏菌（8.1%）。

2.3 沙门氏菌对抗生素的敏感性结果

本研究中耐药率为耐药和中介耐药的菌株在所有菌株中所占的比例，沙门氏菌对21种抗生素的敏感性结果（图1）表明，62株沙门氏菌对磺胺甲基异噁唑的耐药率最高，达90.3%；其次分别为复方新诺明（87.1%）、链霉素（33.0%）、环丙沙星（25.8%）、氨苄西林（22.9%）、氯霉素（21.0%）和四环素（17.7%）。受试菌株对头孢噻吩和庆大霉素最敏感，无耐药菌株出现。

62株受试菌株中，除4株（6.5%）对供试的所有抗生素均表现敏感外，其余58株（93.5%）至少对1种抗生素表现耐药。对1-3种抗生素表现耐药的菌株有33株（53.2%），对4-6种抗生素表现耐药的菌株有17株（27.4%），对7-9种抗生素表现耐药的菌株有8株（12.9%）。对3类或3类以上抗生素表现耐药性的多重耐药菌株有21株，占试验菌株的33.9%（表4）。在多重耐药菌株中，德尔卑沙门氏菌和肠炎沙门氏菌较为常见。

2.4 沙门氏菌对抗生素的敏感性结果

62株沙门氏菌中有16株对环丙沙星耐药，对这些耐药菌株进行PCR扩增得到gyrA、gyrB、parC和parE基因扩增产物，经测序后检出由基因突变引起的氨基酸变异结果（表5）显示，16株耐环丙沙星沙门氏菌的GyrA亚基均出现氨基酸突变，11株在ParC亚基发生突变，而在GyrB和ParE亚基中未检出突变。

2.5 沙门氏菌中PMQR基因检测结果

62株食源性沙门氏菌中qnr基因阳性菌株共7株，占受试菌株的11.3%。qnrA和qnrS基因阳性菌株分别有2株和5株，没有菌株携带qnrB、qnrC和qnrD基因。aac（6'）-Ib基因阳性菌株共8株，占受试菌株的12.9%，其中3株经确认为携带其变体基因aac（6'）-Ib-cr。

3 讨论

本研究在638份样品中共检出62株沙门氏菌，检出率为9.7%。关文英等［12］对河北省3类食品调查发现，沙门氏菌总阳性率为20.9%；在杨保伟等［1］对陕西省零售肉类食品和即食凉拌菜研究中，沙门氏菌检出率为36.8%。同上述地区的研究结果相比，本研究中沙门氏菌检出率较低。值得注意的是，本次检测的生肉类食品中，污染最严重的是牛肉，其次分别为猪肉、羊肉和鸡肉，与关文英等［12］报道的结果基本一致。所分离沙门氏菌的血清型主要为鸭沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌和肠炎沙门氏菌，这些被认为是引发多个国家和地区腹泻型疾病的沙门氏菌血清型，在我国其他省份和各类食品中也均有检出［2］。本研究中，沙门氏菌对除头孢噻吩和庆大霉素以外的19种抗生素均表现出不同程度的耐药，其中对磺胺甲基异噁唑、复方新诺明、链霉素和环丙沙星的耐药率较高，并且有33.9%的菌株呈现多重耐药。

喹诺酮类药物的作用靶位为DNA促旋酶和拓扑异构酶IV，前者由2个GyrA亚基和2个GyrB亚基组成，分别由gyrA和gyrB基因编码；后者由2个ParC亚基和2个ParE亚基组成，分别由parC和parE基因编码。DNA促旋酶和拓扑异构酶IV的QRDR发生氨基酸突变可引起酶的结构与功能改变，从而导致细菌对喹诺酮类耐药。本研究中的数据显示，16株耐环丙沙星沙门氏菌按GyrA和ParC的QRDR不同氨基酸替代组合可分为5种突变型，其中GyrA亚基发生Ser83Phe 和Asp87Gly变异，同时ParC亚基发生Ser80Arg变异为最常见的突变类型。本研究中并未发现只发生parC突变而gyrA没有突变的菌株，与先前的报道结果一致［13］，这也说明了在喹诺酮耐药产生的过程中，只有当gyrA突变存在的情况下，parC突变才能发生并发挥作用。

PMQR机制的发现改变了人们长期以来认为喹诺酮类耐药仅由染色体介导的观点。PMQR基因分布较为广泛，在许多国家和地区的肠杆菌科细菌中均有检出。除了临床菌株，从食品动物中分离的肠杆菌科细菌也可检测到此类基因。Yue等［14］对从广东省家禽和猪中分离的232株大肠杆菌进行qnr基因筛查，14株阳性菌株中有1株携带qnrB，13株携带qnrS。Jiang等［15］发现从养殖鱼类中分离的218株大肠杆菌中分别有33株、21株和5株携带qnrB、qnrS和qnrD基因。然而关于PMQR基因在食源性沙门氏菌中的分布却鲜有报道。Yang等［13］对来自河南省的118株食源性沙门氏菌的研究发现，qnrA、qnrB、qnrS和aac（6'）-Ib的检出率分别高达46.6%、12.7%、19.5%和13.6%，远远高于本研究的结果，这可能与地区差异、菌株数量有限等因素有关。

喹诺酮类是合成抗生素，一直被认为不受修饰酶的影响。但在2006年初Robicsek等［16］首次报道了喹诺酮类修饰酶基因aac（6'）-Ib-cr，其本质上是一种普通氨基糖苷类乙酰转移酶基因aac（6'）-Ib的变异体，两处碱基的突变赋予了其修饰喹诺酮类的特性，两处变异常同时存在。本研究对aac（6'）-Ib的扩增产物进行测序发现有3株菌携带其变体基因aac（6'）-Ib-cr。PMQR基因导致的耐药一般是低水平的，但这并不影响它给临床带来的危害，因为这些耐药基因的存在有利于使菌株对喹诺酮类产生高水平的耐药。PMQR耐药基因的作用机制不同于其它的喹诺酮类耐药机制，这使得其能够在不同细菌中迅速水平传播而导致更大范围的流行。同时，由于PMQR耐药基因常和其它类型的耐药基因共同存在于同一个质粒上，往往造成携带该质粒的菌株表现出多重耐药。

4 结论

本研究从食品中分离的62株沙门氏菌对磺胺甲基异噁唑、复方新诺明、链霉素和环丙沙星的耐药率较高，并且有33.9%的菌株呈现多重耐药。16株耐环丙沙星的沙门氏菌中GyrA亚基发生Ser83Phe和Asp87Gly变异，同时ParC亚基发生Ser80Arg变异为最常见的突变类型。62株菌中qnr基因阳性菌株共有7株，其中qnrA和qnrS基因阳性菌株分别有2株和5株。aac（6'）-Ib基因阳性菌株共有8株，其中3株经确认为携带其变体基因aac（6'）-Ib-cr。

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（责任编辑 马鑫）

Study on Antimicrobial Resistance and Plasmid-mediated Quinolone Resistance of Foodborne Salmonella Isolates

Liu Guishen1Yu Tao2
（1. Chaozhou Institute of Measurement and Testing Technology，Chaozhou 521011；2. Xinxiang University，Xinxiang 453000）

A total of 638 food samples were collected randomly to determine the prevalence ofSalmonella.The overall percentage ofSalmonellaprevalence was 9.7%（n=62）. Among 16 different serotypes identified,S. Anatum was most common. The isolates were frequently resistant to sulfamethoxazole, trimethoprim/sulfamethoxazole, streptomycin, and ciprofloxacin. Five different types of amino acid substitutions were identified in quinolone resistance-determining region（QRDR）of GyrA and ParC of 16 ciprofloxacin-resistant isolates. Double mutations of Ser83Phe and Asp87Gly in GyrA accompanied by an additional mutation of Ser80Arg in ParC were found most frequently. Theqnrgenes were present in seven（11.3%）of 62 isolates, and among them, two isolates carriedqnrAand five carriedqnrS.qnrB,qnrC, andqnrDwere not detected in the isolates in this study. Eight isolates were positive foraac（6'）-Ib, of which three isolates carried the-crvariant. The results suggested the diversity of serotype distribution, serious situation of antimicrobial resistance and the presence of plasmid-mediated quinolone resistance（PMQR）genes in foodborneSalmonellafrom Xinxiang.

FoodborneSalmonellaAntimicrobial resistance Plasmid-mediated Quinolone

2014-01-17

河南省教育厅科学技术研究重点项目（13A610839）

刘贵深，男，高级工程师，研究方向：产品检验及质量管理；E-mail：suyongyu@126.com

于涛，男，讲师，研究方向：环境微生物；E-mail：yutao7777@hotmail.com