启动子结构和功能研究进展

王婧 李冰 刘翠翠 朱阵 张继瑜

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室，兰州 730050）

启动子结构和功能研究进展

王婧 李冰 刘翠翠 朱阵 张继瑜

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室，兰州 730050）

转录起始是一种最重要的表达调节方式，通过多种蛋白质与启动子的配位结合起始转录，参与基因的表达调控过程。而启动子作为基因表达调控的重要顺式作用原件，在原核和真核生物中均存在。对核心启动子结构特征中多种保守顺式调控原件及基本转录因子的结构和功能进行了阐述。

启动子 结构 顺式作用元件 功能 转录因子

生物体所具有的遗传性状，称之为表型，表型是基因型与外界环境因素相互作用的结果。传统研究认为，除环境因素影响外，生物体表型多态性主要是由于相关基因编码区突变造成的。近年研究发现，两个相近物种的蛋白质组成基本相同，却表现出明显的生理学差异。因此，越来越多的学者认为，物种间的差异不仅是基因水平上的不同，而且基因表达调控在其中起很重要的作用。基因表达调控是在不同层次上受到不同的调节因素控制的，这种调控机制不仅决定着基因的表达水平，也决定着基因表达的时空顺序。多种因素参与基因的表达调控过程，如今已发现的有染色质折叠、转录起始、碱基多聚腺苷酸化、mRNA剪接、mRNA稳定性和翻译起始等［1］。其中转录起始作为最主要的一种表达调节方式，通过多种蛋白质与启动子的配位结合起始转录。

启动子在原核和真核生物中均存在，是一段供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，通常位于基因5'端上游区。在辅助因子参与下RNA聚合酶识别并结合在启动子区，开启转录起始过程，因此，启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件，该序列与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子的相互作用是启动子调控的关键。

1 核心启动子结构特征

启动子通过活化RNA聚合酶和相关转录因子，使之与模板DNA特异性结合形成转录起始复合物，调节转录的起始过程。RNA聚合酶有效地识别并结合在启动子区，决定着目的基因的特异性转录。转录起始过程是基因表达调控的关键阶段，RNA聚合酶与启动子区的特异性结合影响转录起始过程，而启动子的结构特征决定它与RNA聚合酶的亲和力，从而调控目的基因的转录水平。核心启动子通常由一些短的保守序列组成，如：转录起始位点、TATA框、CAAT框、BRE元件、DPE元件和MTE元件等（图1）［2］，这些序列的结构特征决定着启动子同RNA聚合酶的识别、结合及起始转录过程。

1.1 转录起始位点

转录起始位点由起始子（Initiator，Inr）组成，该处序列改变主要影响基因的转录速率。起始子作为特异性的核心启动子元件位于转录起点附近，由一段保守的序列组成。研究发现，真核生物启动子均包含起始子序列，其中人类的Inr为YYANWYY，果蝇为TCAKTY，拟南芥由YR（R为转录起点）构成［3］。计算机分析真核生物启动子序列发现，果蝇Inr序列为TCAGTY，同研究发现的果蝇Inr序列基本相同，但是人类Inr序列计算机分析显示为YR，同实际发现的人类Inr序列显著不同，造成该结果出现的原因可能是由于哺乳动物中存在大量的散在的启动子序列［4］。Inr是核心启动子起始转录的特异性序列，通常以A为转录起点（+1）。Inr能够和转录因子TFⅡD特异性结合，促使DNA链在此处解开并起始转录［5］。

1.2 TATA框

TATA框（Goldberg-Hogness box）是最早发现的富含AT碱基对的基本启动子序列元件。在昆虫、高等植物和哺乳动物的细胞基因组中，TATA框均位于Inr位点上游约-25至-30位点处，但在低等真核生物中，TATA框位于Inr位点上游约-80至-100位点。TATA框由8对共有碱基TATAWAAR组成，其中5'端的T位于Inr转录起点上游-31或-30处，TATA框的功能同原核生物启动子的-10序列相似，与RNA聚合酶特异性识别并决定RNA聚合酶的位置［6］。TATA框存在于包括酵母在内的多种真核生物启动子上，其启动子区均包含TATA框，但哺乳动物启动子区中仅有约10%-15%的含有TATA框，研究显示，含有TATA框的基因对转录调控更加敏感。TATA框能特异性结合由多种转录因子和RNA聚合酶形成的转录前起始复合物（Transcription preinitiation complex，PIC），进而调节转录起始。转录起始过程主要分为两步：首先，PIC通过募集转录因子并结合RNA聚合酶定位于TATA框；然后PIC释放RNA聚合酶开启基因转录过程。当PIC持续结合在TATA框，能重复启动基因转录过程，从而促进基因表达水平增高。其中最先结合在TATA框的转录因子是TFⅡD，其作为一种寡聚蛋白，是TATA框结合蛋白（TATA-binding protein，TBP）和多种TBP联结因子（TBP-associated factor，TAF）组成的复合物。TBP通过结合于DNA小沟处的TATA框，使DNA弯曲成约80，有利于双链DNA解开［7］。

1.3 CAAT框

CAAT框（CAAT box）是较早发现的真核生物启动子元件之一，位于Inr下游约-75位点处。CAAT框的共有序列是GCCAATCT，在真核生物基因组中CAAT框的序列高度保守。CAAT框作为最基本的启动子元件，能够结合通用转录因子（General transcription factor，GTF）家族的CP1、CP2和核因子NF-1［8］。而转录因子C/EBP蛋白是含有4个重复亮氨酸结构单位的同源二聚体，可以同时与CAAT框和增强子序列两个特定的位点相结合，从而控制转录起始的频率。研究发现，CAAT框距转录起始点Inr较远时，仍然能发挥调节转录起始频率的功效，且正反两种取向均可发挥作用，CAAT框对碱基突变十分敏感，一旦缺失或突变将导致转录效率的急剧降低，但是突变对启动子的特异性没有影响［9］。

1.4 BRE元件

BRE元件（TFⅡB recognition element，BRE）最初作为调节因子TFⅡB的结合序列被发现，BRE约占TATA框的10%-30%，并定位于TATA框上游。TFⅡB作为基本的转录起始因子之一，TFⅡB的主要功能是使RNA聚合酶正确定位，起“定位因子（Positioning factor）”作用［10］。后来有学者发现另一个TFⅡB识别位点BREd（Downstream TFⅡB recognition element，BREd）， 与BRE不 同，BREd定位于TATA框下游。而且因BREd的出现，将先前发现的BRE重新命名为BREu［11］。研究显示，BREu和BREd共同结合TATA框来调节基本转录水平，它们可以极大地提高基本启动子的低水平转录活性［12］。然而研究果蝇Hox基因发现，BREu作为转录因子Caudal的特异性抑制剂，发挥抑制Hox基因转录活性的功效［13］。

1.5 DPE元件

DPE元 件（Downstream core promoter element，DPE）作为TFⅡD识别的启动子序列元件，位于Inr下游约+28至+33位点处。从果蝇到人类启动子区均发现DPE元件的存在，而且其序列高度保守，但酵母启动子区不含DPE元件。研究发现，在DPE存在的启动子中，一般不存在其他启动子元件，DPE元件和Inr的距离决定着启动子的转录活性。在不含TATA框的启动子中，DPE作为转录激活子特异性识别的序列促进基因转录起始。在果蝇Hox基因中，几乎所有Hox基因家族成员启动子均没有TATA框，推测DPE是该基因的转录激活元件［14］。后续研究发现，Caudal蛋白作为激活DPE元件的特异性识别因子，调节Hox基因的表达。进一步研究发现，Caudal蛋白除能够特异性识别DPE元件外，BREu与TATA框结合能够部分抑制Caudal的作用，因此Caudal蛋白的激活作用因启动子元件不同，发挥不同的转录激活功效（图2），在DPE元件存在时发挥最强的激活作用，在TATA框存在但不含BREu元件时激活作用较弱，在BREu和TATA框同时存在时基因的转录活性最低［15］。

1.6 MTE元件

MTE元件（Motiften element，MTE）是过表达基因启动子序列的功能性激活启动子元件，MTE定位于DPE元件上游，处于Inr下游+18至+27位点，该序列元件在果蝇和人类基因组DNA中高度保守。DNaseⅠ足迹法证实，MTE元件同DPE元件相似，都是转录因子TFⅡD特异性识别的序列元件［16］。MTE元件的功能同Inr相关，但可以单独激活TATA框和DPE元件，MTE元件可以分别和TATA框或DPE元件发挥协同作用。参考以上启动子元件，有学者设计了包含Inr、TATA框、DPE和MTE元件的超级启动子（Super core promoter，SCP），SCP在体外培养细胞中具有很高的转录活性，进一步同转录增强子结合后，能够调控基因高效表达［16］。

2 基本转录因子

真核生物的启动子主要有3类，分别由RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ进行转录，而且每一种酶均有其识别的不同类型的启动子［17］。RNA聚合酶Ⅰ转录45S rRNA前体；RNA聚合酶Ⅱ转录所有编码蛋白质的基因和部分核内小RNA；RNA聚合酶Ⅲ转录包括tRNA、5S rRNA和snRNA等［17］。其中RNA聚合酶Ⅰ和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子，组成的顺式作用元件种类有限，而RNA聚合酶Ⅱ的启动子序列由各种顺式作用元件组成，分散在转录起点上约200 bp范围内。RNA聚合酶Ⅱ识别的核心启动子包括转录起点附近-40至+40位点的范围，包括几乎所有上述的启动子区顺式作用元件。研究发现，纯化的RNA聚合酶Ⅱ能够以DNA为模板合成RNA，但是不能与核心启动子识别，因此必须借助各种转录因子才能结合到核心启动子上［17］。

目前已发现的基本转录因子有TFⅡA（Transcription Factor for RNA polymerase Ⅱ A，TFⅡA）、TF-ⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF和TFⅡH。体外研究发现，纯化的RNA聚合酶Ⅱ结合转录因子TFⅡB、TF-ⅡD、TFⅡE、TFⅡF和TFⅡH，能够促使含TATA框的核心启动子转录，而相同的转录因子参与却不能激活含DPE元件的核心启动子转录活性［18］。另外，NC2（Negative cofactor 2）作为含TATA框核心启动子的阻抑物，同时又是含DPE元件的核心启动子的激活物。部分TATA框和DPE元件核心启动子的激活具有可控性，TBP激活TATA框核心启动子转录活性的同时，能够抑制DPE元件核心启动子活性，而且NC2和Mot1能够阻断TBP同DNA的结合，进而抑制TBP与TATA框的结合，发挥促进DPE元件核心启动子转录，抑制TATA框核心启动子转录的功能［19］。

TFⅡD是参与核心启动子识别最关键的转录因子之一，为一种寡聚蛋白，是由TBP和12种TAF组成的复合物。其中TBP亚基能够结合于DNA小沟处的TATA框，使DNA弯曲成约80，促进双链DNA解开。TAF1和TAF2亚基能够识别Inr，其中的TAF1亚基靠近DCE元件。TAF6和TAF9亚基识别并定位于DPE元件（图3）［20］。TFⅡD也可以和RNA聚合酶Ⅱ的C端结构域直接作用，从而使RNA聚合酶Ⅱ定位于Inr，起始转录过程［21］。除TFⅡD介导的启动子识别过程外，还有多种核心启动子识别机制存在。

研究证实，同TFⅡD的功能相似，其他的基本转录因子也参与早期转录过程，TFⅡA具有促进TBP同TATA框结合的作用，当TFⅡD通过TAF识别并定位于启动子上后，TFⅡA随后结合到该蛋白DNA复合物上，发挥稳定TFⅡD同启动子结合的功能。TFⅡB有两个结构域，分别结合TBP和TFⅡF/ pol Ⅱ复合物，TFⅡB和TBP相互结合有助于促进聚合酶Ⅱ与核心启动子的识别和定位，TFⅡB可以结合在启动子序列的BREu和BREd元件区，并稳定TBP同TATA框的结合［22］。TFⅡF由两个亚基组成，较大的亚基具有依赖ATP的DNA解螺旋酶活性，可能参与起点DNA的解链过程；较小的亚基能与RNA聚合酶Ⅱ稳定结合，维持TFⅡF与RNA聚合酶Ⅱ形成的复合物，直至转入延伸阶段，大部分转录因子均离去，只有TFⅡF与一些延伸因子参与其中。TFⅡF除与转录过程有关外，还参与DNA损伤的切除修复过程［23］。TFⅡE在RNA聚合酶Ⅱ的帮助下能够进入启动子结合位点，进而引入TFⅡH。TFⅡE和TFⅡH均为多亚基因子，虽然二者与转录的起始反应无关，但是发挥启动子清除作用，为转录起始转入延伸阶段做准备。TFⅡH具有ATP酶、解螺旋酶和激酶等多种酶活性，其中它的激酶活性能够催化RNA聚合酶Ⅱ大亚基羧基端结构域多个位点磷酸化，促使转录复合物构象改变，进而促进转录过程［24］。

3 增强子

在真核细胞基因组中除启动子外，能够促进基因转录的保守序列称为增强子。增强子早在1981年首次从DNA病毒SV40中发现，位于转录起点上游约200 bp处，由两个串联的正向重复的72 bp序列组成，删除该序列后显著降低了SV40基因的转录活性，证明该序列能大大提高基因的表达水平，因此称为增强子。目前发现的增强子通常是由重复的8-12 bp“核心序列”组成的，SV40增强子的核心序列是GGTGTGGAAAG。研究表明，SV40增强子不仅能够促进自身启动子转录，而且能促进激活所用通过重组与其相连的启动子，包括哺乳动物、禽类及其他病毒基因［25］。同启动子相比，增强子有两个明显的特点：一是增强子与启动子的相对位置不固定，但同样能够发挥增强转录作用。增强子无论在启动子上游或下游，甚至和启动子间隔几千个碱基对，只要位于同一DNA分子上均能发挥作用。当增强子附近同时存在多个启动子时，优先作用于最近的启动子。增强子的这一特性，可能是由于DNA分子具有一定的柔性，可以任意弯曲，因此结合在增强子上的激活因子能够与转录复合物相互作用。二是增强子无方向限制。增强子按正反方向插入均能发挥作用，这一点同启动子有显著不同［26］。

在酵母中存在类似的增强子，称为上游激活序列（Upstream activation sequence，UAS）。UAS能在两个方向并位于启动子上游的任何距离处发挥作用，但在启动子下游则无作用。多数增强子的增强效应具有显著的组织特异性，它往往优先或只能在某种特定类型的细胞中表现功能。研究证实，免疫球蛋白基因的增强子只有在B淋巴胞内表现出最高的活性。胰岛素和胰凝乳蛋白酶基因增强子同样具有很强的组织特异性［27］。而且许多病毒要求一定的宿主范围可能和增强子的特异性有关。

上述研究增强子性质发现，细胞内存在一些特异的蛋白能够和增强子相互作用，介导增强子远距离和无方向性的作用于最近的启动子，促使启动子易于和RNA聚合酶Ⅱ或转录复合物结合，从而影响转录［28］。足迹法显示，增强子常位于DNA酶的超敏感部位。所有的增强子中均有一段由嘧啶-嘌呤残基交替组成的碱基序列，这种序列极易形成Z-DNA型，据此推测在增强子序列形成一小段Z-DNA后，增强子才有功能［29］。除组织专一型增强子外，还存在一类诱导型增强子。研究小鼠乳腺肿瘤病毒发现，糖类固醇激素能激活该病毒启动子的转录活性，在转录起点上游约100 bp处有一段序列，能够结合激素及其蛋白受体复合物，从而起始基因的转录。后续研究发现，该序列在启动子任一方向及不同距离时均能发挥作用，推测该序列为糖类固醇激素诱导型的增强子［30］。增强子作用机制研究表明，增强子与启动子上游调控元件并无本质区别，某些保守序列在二者中都有，只是在增强子中相对更加集中。

4 展望

上述研究表明，核心启动子元件和基本转录因子的共同作用调控转录活性，负责和RNA聚合酶结合，启动最基本的转录过程，决定了基因表达的起始点和效率。核心启动子和基本转录因子结构和功能的多样性，导致生物体在遗传进化过程的表型多态性。因此通过研究转录相关序列和蛋白因子的作用机理，为阐明基因表达的调控机制提供条件。但是除核心启动子外，在转录起始点更上游位置存在着促使基因基本或特异性表达的顺式作用元件，如增强子、沉默子和一些没有统一结构的序列等，它们可能对基因的特异性表达起重要的作用，但是由于结构和功能的复杂性，很难将它们分离鉴定。目前能够分离并应用的只有核心启动子元件及其相关的基本转录因子，通过构建含有TATA框和DPE元件的载体，不仅为基因功能的研究奠定基础，同时也为进一步揭示基因的表达调控机制创造条件。

［1］Bajic VB, Brent MR, Brown RH, et al. Performance assessment of promoter predictions on ENCODE regions in the EGASP experiment［J］. Genome Biol, 2006, 7（Suppl 1：S3）：1-13.

［2］Barroso-delJesus A, Romero-Lopez C, Lucena-Aguilar G, et al. Embryonic stem cell-specific miR302-367 cluster：human gene structure and functional characterization of its core promoter［J］. Mol Cell Biol, 2008, 28（21）：6609-6619.

［3］Luse DS. Promoter clearance by RNA polymerase II［J］. Biochim Biophys Acta, 2013, 1829（1）：63-68.

［4］Campbell EA, Muzzin O, Chlenov M, et al. Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit［J］. Mol Cell, 2002, 9（3）：527-539.

［5］Ding W, Bellusci S, Shi W, et al. Genomic structure and promoter characterization of the human Sprouty4 gene, a novel regulator of lung morphogenesis［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004, 287（1）：L52-59.

［6］Emoto M, Miki M, Sarker AH, et al. Structure and transcription promoter activity of mouse flap endonuclease 1 gene：alternative splicing and bidirectional promoter［J］. Gene, 2005, 357（1）：47-54.

［7］Chai X, Chen W, Napoli JL. Structure, promoter and chromosomal localization of rdh6［J］. Gene, 2001, 274（1-2）：27-33.

［8］Hernandez-Rodriguez CS, Ferre J, Herrero S. Genomic structure and promoter analysis of pathogen-induced repat genes from Spodopteraexigua［J］. Insect Mol Biol, 2009, 18（1）：77-85.

［9］Kharitonova MA, Vershinina VI, Morozova OV, et al. The role of the promoter structure in the efficiency of the expression of guanylspecific ribonucleases from Bacillus intermedius and Bacillus pumilus］［J］. Mol Gen Mikrobiol Virusol, 2006（4）：15-19.

［10］Labrador M, Corces VG. Phosphorylation of histone H3 during transcriptional activation depends on promoter structure［J］. Genes Dev, 2003, 17（1）：43-48.

［11］Laenen K, Haegeman G, Vanhoenacker P. Structure of the human 5-HT7 receptor gene and characterization of its promoter region［J］. Gene, 2007, 391（1-2）：252-263.

［12］Lawson J, Wheldrake JF, Dunbar AJ. Genomic structure and promoter characterization of the gene encoding the ErbB ligand betacellulin［J］. Biochim Biophys Acta, 2002, 1576（1-2）：183-190.

［13］Li SF, Fujita F, Hirai M, et al. Genomic structure and characterization of the promoter region of the human NAK gene［J］. Gene, 2003, 304：57-64.

［14］Luo J, Cun W, Che Y, et al. Analysis of HSV-I ICP22 effects on HCMV major immediate-early promoter structure［J］. Sci China C Life Sci, 2007, 50（3）：292-297.

［15］Martin CT, Esposito EA, Theis K, et al. Structure and function in promoter escape by T7 RNA polymerase［J］. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 2005, 80：323-347.

［16］Marsman J, Horsfield JA. Long distance relationships：enhancerpromoter communication and dynamic gene transcription［J］. Biochim Biophys Acta, 2012, 1819（11-12）：1217-1227.

［17］ Putthoff P, Akyuz N, Kutsche M, et al. Structure of the murine tenascin-R gene and functional characterisation of the promoter［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 308（4）：940-949.

［18］Toscano-Garibay JD, Aquino-Jarquin G. Regulation exerted by miRNAs in the promoter and UTR sequences：MDR1/P-gp expression as a particular case［J］. DNA Cell Biol, 2012, 31（8）：1358-1364.

［19］Shavandi M, Sadeghizadeh M, Khajeh K, et al. Genomic structure and promoter analysis of the dsz operon for dibenzothiophene biodesulfurization from Gordonia alkanivorans RIPI90A［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 87（4）：1455-1461.

［20］Sobocki T, Sobocka MB, Babinska A, et al. Genomic structure, organization and promoter analysis of the human F11R/F11 receptor/junctional adhesion molecule-1/JAM-A［J］. Gene, 2006, 366（1）：128-144.

［21］Stohr J. Prion protein aggregation and fibrillogenesis in vitro［J］. Subcell Biochem, 2012, 65：91-108.

［22］Thomas AV, Broers AD, Vandegaart HF, et al. Genomic structure, promoter analysis and expression of the porcine（Sus scrofa）TLR4 gene［J］. Mol Immunol, 2006, 43（6）：653-659.

［23］ Tobias CM, Chow EK. Structure of the cinnamyl-alcohol dehydrogenase gene family in rice and promoter activity of a member associated with lignification［J］. Planta, 2005, 220（5）：678-688.

［24］Yan BX, Ma JX. Promoter-associated RNAs and promoter-targeted RNAs［J］. Cell Mol Life Sci, 2012, 69（17）：2833-2842.

［25］Young CS. The structure and function of the adenovirus major late promoter［J］. Curr Top Microbiol Immunol, 2003, 272：213-249.

［26］Zhang CK, Lin W, Cai YN, et al. Characterization of the genomic structure and tissue-specific promoter of the human nuclear receptor NR5A2（hB1F）gene［J］. Gene, 2001, 273（2）：239-249.

［27］Burden S, Lin YX, Zhang R. Improving promoter prediction for the NNPP2.2 algorithm：a case study using Escherichia coli DNA sequences［J］. Bioinformatics, 2005, 21（5）：601-607.

［28］Dikstein R. The unexpected traits associated with core promoter elements［J］.Transcription, 2011, 2（5）：201-206.

［29］Zhang MQ. Computational analyses of eukaryotic promoters［J］. BMC Bioinformatics, 2007, 8（Suppl 6）：S3.

［30］Xia Y, Saitoh T, Ueda K, et al. Characterization of the human alpha-synuclein gene：Genomic structure, transcription start site, promoter region and polymorphisms［J］. J Alzheimers Dis, 2001, 3（5）：485-494.

（责任编辑 狄艳红）

Advances of the Studies on Structure and Function of Promoter

Wang Jing Li Bing Liu Cuicui Zhu Zhen Zhang Jiyu
（Key Laboratory for Veterinary Drug Innovation，Ministry of Agriculture，Lanzhou Institute of Husbandry and Veterinary Pharmaceutical Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050）

Gene expression and its regulation are dependent, on to a great extent, on transciption. An elementary transciption reaction is initiated by the recognition of regulatory regions and especially promoters. Promoters is the cis-regulatory element of gene expression and its regulation, exsit in eukaryotes and prokaryotes. This paper expounded on the general characteristics and the function of promoter segment and cis-element functions.

Promoter Structure cis-acting elements Function Transcription factor

2013-11-22

国家肉牛牦牛产业技术体系建设专项资金（CARS-38）

王婧，女，博士研究生，研究方向：兽医药理学与新药创制；E-mail：kenhtsjj@163.com

张继瑜，男，研究员，博士生导师，研究方向：兽用药物及其基础；E-mail：infzjy@sina.com