烟粉虱全基因组DNA四种提取方法的比较

戴恬美吕志创万方浩，2

（1.中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点研究室，北京 100193；2.农业部外来入侵生物预防与控制研究中心，北京 100193）

烟粉虱全基因组DNA四种提取方法的比较

戴恬美1吕志创1万方浩1，2

（1.中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点研究室，北京 100193；2.农业部外来入侵生物预防与控制研究中心，北京 100193）

获得大量、高质量的全基因组DNA是在DNA水平上研究许多生物的分子机制的基本前提。微小昆虫由于其体型微小，单头提取DNA浓度低，无法满足部分试验所需。为寻找一种方便、快捷、高效的全基因组提取方法，参考国内外单头微小昆虫基因组DNA提取常用方法，以烟粉虱为研究材料，选取醋酸钾（KAc）法、盐析法、氯仿-异戊醇法和苯酚提取法四种方法进行多头烟粉虱的全基因组DNA提取。通过微量核酸蛋白分析仪、基因组DNA直接琼脂糖凝胶电泳、甲基化敏感扩增多态性（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳对DNA样品进行检测，比较提取DNA的产量、质量，并综合分析各提取方法所需时间及所用试剂的毒性大小。结果表明，盐析法提取的DNA平均浓度为521 ng/μL，纯度能满足分子检测要求，用MSAP引物能得到较好的扩增结果，相比其它方法，盐析法更简便、快速且无毒。因此盐析法是多头烟粉虱全基因组DNA提取的最佳方法。

DNA提取 烟粉虱 KAc法 氯仿-异戊醇法 盐析法 苯酚法

烟 粉 虱Bemisia tabaci（Gennadius） 属 半 翅目（Hemiptera），粉虱科（Aleyrodidae），小粉虱属Bemisia，是多食性的刺吸性害虫，主要分布在热带和亚热带地区［1］。烟粉虱是一个包含30个以上隐种的物种复合体［2-5］，其中Middle East-Asia Minor1（MEAM1）隐种和 Mediterranean（MED）隐种入侵我国后凭借其寄主范围广、产卵量大、温度耐受性强、抗药性强、传播病毒等特点，迅速扩散到我国绝大部分省份，并逐渐取代本地隐种，占据优势地位［6］。烟粉虱主要通过取食植物韧皮部汁液、引起植物生理混乱、传播植物病毒、分泌蜜露诱发真菌病害等方式，成为为害我国蔬菜、花卉等作物上的主要害虫，对我国农业生产造成了严重的经济损失［7］。

烟粉虱遗传结构复杂且多样性高，但其个体微小，各隐种在形态上无法鉴别［3，6］，故利用分子生物学技术从核酸水平对其进行物种鉴定、分类［8］以及研究其种间亲缘关系、生物学特性［9］等已成为研究其生物系统学和生物进化学的重要手段之一，而核酸水平研究的第一步最关键的步骤是获得物种的DNA。目前，烟粉虱DNA提取方法一般都是针对单头昆虫，但由于单头烟粉虱提取的DNA浓度低，低浓度的DNA无法满足对部分试验研究的要求。因此，寻找既能满足研究所用的需求，同时又简便、快捷、有效，且能降低对操作人员的毒害等的进行多头、大量提取全基因组DNA的提取方法，成为试验中首要解决的问题。

本研究借鉴国内外应用较多的提取昆虫DNA的4种方法，即KAc法、盐析法、氯仿-异戊醇法和苯酚法，对各提取方法稍作改动或改进，以烟粉虱为材料，通过微量核酸蛋白分析仪、基因组DNA直接琼脂糖凝胶电泳和甲基化敏感扩增多态性（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳进行检测，对4种方法所提取的基因组DNA质量和产量进行了比较，并结合DNA提取所需时间、操作难易程度和所用试剂的毒性大小进行综合比较，旨在寻找最佳的烟粉虱全基因组DNA提取方法，为今后广泛开展烟粉虱亲缘关系分析、基因组比较、遗传多样性和某些特定基因的标记等分子生物学研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源 烟粉虱MED（Mediterranean）隐种采自中国农业科学院植物保护研究所生物入侵研究室长期饲养的种群，寄主植物为番茄Lycopersicon lycopersicumMill（Solanales：Solanaceae）（中杂9号）（购自北京中蔬园艺良种研究开发中心），无用药史，饲养温度为（26±1）℃，相对湿度为60%-80%，光周期为16L∶8D。

1.1.2 主要试剂、溶液及仪器 试验所用PCR仪为美国MJ公司的PTC-200，凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司，小型台式高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司的5424R，超微量核酸蛋白分析仪为德国IMPLEN公司的P330。

主要试剂有蛋白酶K、Taq酶（购自全式金生物技术（北京）有限公司），T4连接酶（购自宝日医生物技术（北京）有限公司），EcoRⅠ酶、HpaⅡ酶和MseⅠ酶（购自纽英伦生物技术（北京）有限公司），其余试剂为国产分析纯。引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 全基因组DNA的提取方法

1.2.1.1 KAc法 参照吕志创［10］的方法，稍加改进。提 取 缓 冲液（pH8.0）：1 mol/L Tris-HCl，5 mol/L NaCl，0.5 mol/L EDTA，10% SDS。（1）取约100头烟粉虱成虫，液氮冷冻3 min后，加入50 μL提取缓冲液研磨匀浆；（2）吸取250 μL提取缓冲液分3次清洗研棒并混匀；（3）向管中加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），充分混匀，60℃水浴2 h（中途混匀1次），100℃沸水浴5 min；（4）向管中加入1倍体积KAc（3 mol/L）抽提，冰浴2 h，4℃、12 000 r/min、离心15 min，重复此步骤一次；（5）取上清液，加入2倍体积预冷无水乙醇，冰浴2 h，4℃、12 000 r/min、离心15 min，小心弃去上清液；（6）加入2倍体积预冷75%乙醇洗涤，4℃、12 000 r/min、离心15 min，自然干燥沉淀，溶于30 μL灭菌ddH2O，-20℃保存备用。

1.2.1.2 KAc改良法 将1.2.1.1中步骤（3）改为：向管中加入5 μL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，充分混匀，60℃水浴1 h，中途混匀1次；步骤（4）改为：100℃沸水浴5 min后加入1倍体积KAc（3 mol/L）抽提1次，冰浴1 h，4℃、12 000 r/min、离心15 min；步骤（5）取上清液，加入 2倍体积预冷无水乙醇，冰浴1 h，4℃、12 000 r/min、离心15 min，小心弃去上清液；其余步骤同1.2.1.1。

1.2.1.3 盐析法 参照滕希等［11］的方法，稍加改进。提取缓冲液：50 mmol/L Tris-Cl，pH7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，0.5% SDS。（1）取约100头烟粉虱成虫，液氮冷冻3 min后，加入20 μL提取缓冲液，研磨棒研磨；（2）吸取280 μL提取缓冲液分3次清洗研棒后混匀，再加入5 μL蛋白酶K，轻摇混匀，60℃水浴1 h（中间混匀1次）；（3）加入100 μL 5 mol/L NaCl，充分震荡15 s，4℃、14 000 r/min、离心10 min，弃蛋白质沉淀，移上清液到另一离心管中；（4）加入400 μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，-20℃放置30 min；（5）4℃、14 000 r/min、离心10 min，弃上清液；加入400 μL预冷的75% 乙醇洗涤，4℃、14 000 r/min、离心10 min，弃上清液；（6）在室温下干燥，然后加30 μL灭菌ddH2O，充分溶解后，-20℃保存备用。

1.2.1.4 氯仿-异戊醇法 参照周志湘等［12］的方法。提取缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1% SDS，20 mmol/L NaCl，pH8.0。

（1）取约100头烟粉虱成虫，液氮冷冻3 min后，加入50 μL提取缓冲液研磨匀浆；（2）吸取250 μL缓冲液分3次清洗匀浆液并混匀，加入5 μL蛋白酶K，充分混匀，于60℃水浴1 h（中间取出摇动混匀1次），然后沸水浴5 min；（3）加入300 μL氯仿∶异戊醇24∶1抽提液，轻柔混匀数十次，冰上放置40 min，4℃、14 000 r/min、离心10 min，移上清液到另一离心管中；（4）加入600 μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，-20℃放置1 h；（5）4℃、12 000 r/min、离心15 min，小心弃去上清液，加入600 μL预冷的75% 乙醇洗涤，4℃、12 000 r/min、15 min，小心弃去上清液；（6）室温下干燥，加30 μL灭菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存备用。

1.2.1.5 酚提取法 参照Bender等［13］的方法。提取液：100 mmol/L NaCl，200 mmol/L蔗糖，50 mmol/L EDTA，0.5% SDS，100 mmol/L Tris-HCl pH9.1。（1）取约100头烟粉虱成虫，液氮冷冻3 min后，加入100 μL提取液，5 μL蛋白酶K。（2）研磨棒充分研磨后，300 μL提取液冲洗研磨棒；将管（共含400 μL提取液）置于65℃下培养30 min。（3）在管仍保持余热时加入56 μL 8 mol/L醋酸钾，颠倒混匀，冰浴30 min。（4）室温下14 000 r/min离心15 min，转移上清液至干净的离心管内。（5）室温下14 000 r/min离心10 min，转移上清液至干净的离心管内。（6）加入5 μL 10 mg/mL RNaseA，37℃保温培养30 min。（7）加入400 μL苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），涡旋混匀。（8）室温下14 000 r/min离心10 min，转移上清至新离心管。（9）向管内加入400 μL氯仿∶异戊醇（24∶1），涡旋混匀，室温下14 000 r/min离心10 min。（10）移上清至新管内，加入200 μL 7.5 mol/L醋酸铵和800 μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀。（11）室温下静置10 min，室温下14 000 r/min离心15 min，倒掉上清。（12）用500 μL 75%乙醇洗涤沉淀，室温下14 000 r/min离心5 min，倒掉上清。（13）洗掉管内残余乙醇，空气干燥4-5 min后加入30 μL ddH2O 溶解DNA，-20℃保存备用。

1.2.2 基因组DNA的检测

1.2.2.1 微量核酸蛋白分析仪检测 以ddH2O作为空白对照，取所提DNA样品0.3 μL，微量核酸蛋白分析仪测定其OD260/OD280、OD260/OD230值及DNA样品的纯度。OD260/D280比值在1.8左右表明DNA优质，低值表明蛋白污染，数值越高，表明RNA污染。OD260/OD230比值一般大于2，小于2说明去盐不充

分［14，15］。

1.2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测 取所提DNA样品1 μL稀释4倍，上样于0.8%琼脂糖凝胶电泳，100 V，30 min电泳检测，凝胶成像系统观察条带的清晰度和完整度。

1.2.2.3 MSAP扩增检测 参照文献［16］，选用EcoRⅠ酶切接头序列为5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'，5'-AATTGGTACGCAGTCTAC-3'，基本引物序列为5'-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3'；HpaⅡ-MspⅠ酶切接头序列为5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'，5'-CGTTCTAGACTCATC-3'，其扩增引物为5'-GATGAGTCTAGAACGGT-3'。

酶切反应体系为50 μL：其中1 μg DNA，7.5 UEcoR I，7.5 UHpaⅡ/MspⅠ酶，5 μL Buffer，加ddH2O至50 μL。反应混合物混合均匀后，37℃酶切8 h后进行连接反应，反应总体积为25 μL：其中5 μL酶切产物，5 pmolEcoR I接头，50 pmolHpaⅡ/MspⅠ接头，2.5 U T4连接酶，2.5 μL 10×连接buffer，12 μL ddH2O。反应混合物混合均匀后，16℃过夜，取出65℃灭活10 min，稀释10倍后，-20℃保存。

扩增反应体系为20 μL：其中5 μL连接产物，30 pmolEcoR I引物和30 pmolHpaⅡ/MspI引物，1 UTaq酶，2 μL 10×ExTaq酶buffer，2 μL dNTP，6.5μL ddH2O。PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，25个循环；72℃延伸7 min。

取PCR产物1 μL稀释4倍，1%琼脂糖凝胶电泳进行电泳检测，100 V，30 min，凝胶成像系统观察条带的清晰度和完整度。

2 结果

2.1 DNA纯度检测

如表1所示，4种方法提取的烟粉虱基因组DNA的纯度与比值各不相同。其中，KAc法、KAc改良法、氯仿-异戊醇法提取效果最好，得到的DNA颜色洁白透明，OD260/OD280值在1.8左右，OD260/OD230值在2.0左右，基本无蛋白质和RNA污染，但氯仿-异戊醇法提取的DNA浓度比KAc法提取的低。盐析法得到的DNA颜色也洁白透明且浓度较高，但样品OD260/OD280值均在1.900以上，表明样品存在一定的RNA污染。苯酚法提取的效果最差，OD260/OD230值在1.000左右，表明含有较高杂质，苯酚法提取的第3组重复得到的DNA颜色呈黄色，难溶解，DNA浓度也偏低。

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测

4种方法提取的DNA样本直接在0.8%琼脂糖上电泳的分离效果（图1）显示，烟粉虱的基因组大小在23 kb以上。不同方法提取的基因组DNA电泳条带差别较大。其中氯仿-异戊醇法提取的DNA电泳条带最明亮清晰，表明提取的DNA完整性较高，且浓度较纯。其次是盐析法，但盐析法在底部显示出弥散的一团，可能是试验中RNA没有除净或DNA降解了。KAc法、KAc改良法在23 kb处有较模糊的条带，同时底部也显示出弥散的一团，且较明亮，结合微量核酸蛋白分析仪检测结果，可能是DNA大部分降解的缘故。苯酚法提取的DNA电泳条带显示，没有得到完整的基因组DNA条带。

2.3 MSAP扩增检测

4种方法提取的DNA样本MSAP引物的扩增产物在1%琼脂糖上电泳的分离效果（图2）显示，烟粉虱全基因组酶切后扩增产物片段集中在500 bp-2 kb。不同方法提取的全基因组DNA均有扩增产物。盐析法和氯仿-异戊醇法均得到较明亮且集中的片段区域，扩增效果高效，表明所提取的全基因组DNA能酶切完全并可用作PCR模板，且所含蛋白质、多糖类等杂质少，其纯度完全能达到RFLP、AFLP、ISSR、RAPD、COI分析等分子生物学的研究。KAc改良法和苯酚法得到的片段区域亮度相对较弱，KAc法得到的片段区域亮度非常低，整体结果与基因组DNA电泳图结果相似，即提取全基因组DNA时的降解程度对DNA扩增效率有直接影响，降解程度过高可能导致得不到扩增产物。

3 讨论

昆虫DNA提取与植物DNA提取不同，植物细胞有细胞壁且富含多种次生代谢产物，提取时主要杂质为蛋白质、多糖、多酚、单宁等，一般通过SDS和CTAB法去除，而昆虫DNA提取时，蛋白质、脂类物质是影响DNA提取的主要障碍，目前国内去除此类杂质通常采用的方法是氯仿-异戊醇法和KAc法，而盐析法和苯酚法是国外用分子标记技术研究蚜虫等小型昆虫种群遗传结构时使用较多的方法。本研究使用以上4种有代表性的昆虫DNA提取方法对大量烟粉虱全基因组DNA进行提取，并对其提取效果进行了比较。在提取纯度方面，KAc法、KAc改良法、氯仿-异戊醇法提取纯度最高，基本无蛋白质和RNA污染，盐析法得到的DNA可能存在轻微的RNA污染，苯酚法得到的DNA样品含较多其它杂质，纯度最低；在提取完整性方面，盐析法和氯仿-异戊醇法提取质量最高，其次是KAc改良法，KAc法和苯酚法存在不同程度的降解；在PCR扩增试验中，盐析法和氯仿-异戊醇法均能得到有效的扩增产物，虽然盐析法中存在的轻微杂质残留但不影响其后续的扩增。综合比较盐析法和氯仿-异戊醇法提取效果最佳，但氯仿-异戊醇法提取过程中，所使用的氯仿极易挥发，对皮肤、眼睛、黏膜和呼吸道有刺激作用，是一种致癌剂，异戊醇亦可因吸入或皮肤吸收而受害并有严重损伤眼睛的危害［17］。

4 结论

遵循简便、经济、有效、无毒的原则，盐析法提取的全基因组DNA不仅提取量大、浓度高，得到的昆虫全基因组DNA样本的质量能满足PCR等分子生物学分析的要求，且操作简单，耗时较短，能避免使用对人体损伤较大的有机溶剂，故而是一种值得推广的烟粉虱全基因组DNA提取方法。此外，氯仿-异戊醇法获得的基因组DNA虽然浓度低，但质量非常好，因此，其在对DNA质量要求高的试验中具有很大的应用价值。

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（责任编辑 李楠）

Comparison of Four Methods for Whole Genomic DNA Extraction from Bemisia tabaci

Dai Tianmei1Lü Zhichuang1Wan Fanghao1，2
（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；2. Center for Management of Invasive Alien Species Ministry of Agriculture，Beijing 100193）

Obtaining high-quality DNA is a prerequisite to study the molecular mechanisms of many organisms. For tiny insects, low DNA concentration（from one single insect）is unable to meet the need of some experiments. To find a convenient and efficient method for whiteflies genome extraction, KAc, salting-out, chloroform-isoamylol and phenol methods were used to extract bull whiteflies genome DNA, respectively. The efficiency of different DNA extraction methods were evaluated by comparing the concentration, purity, PCR products of DNA, extraction time and the toxicity of the reagents, respectively. The results showed that the average concentration of DNA extraction of salting-out method was 521 ng/μL, and the purity could meet the experiment requirements, and the PCR product brand of MSAP primer amplification was bright. Compared to other methods, salting-out method was more simple, rapid and non-toxic. Therefore, salting-out method was the best ideally method to extract the whole genomic DNA from whiteflies.

DNA extraction Bemisia tabaci KAc method Chloroform-isoamylol method Salting-out method Phenol method

2014-01-24

国家自然科学基金项目（31100269），“973”计划（2009CB119200），公益性行业（农业）科研专项（201303019）

戴恬美，女，硕士研究生，研究方向：入侵生物学；E-mail：dai.tian.mei@163.com

万方浩，男，博士，研究员，研究方向：入侵生物学；E-mail：wanfanghao@caas.cn