蛇毒抗菌肽OH-CATH对大肠杆菌引起家兔涤纶补片感染的保护作用研究

李思熳，余果宇，申吉泓，翟国敏，高振华

0 引言

涤纶补片是常用的生物体内修复材料，植入人体后可吸附血浆蛋白，主要为纤维连接蛋白、球蛋白、纤维蛋白原和清蛋白，而有利于细菌的黏附易造成以生物材料为中心的感染［1-2］，而一旦产生细菌性生物膜，一般的抗菌治疗难以奏效［3］，因此如何防止生物膜的产生，是解决人工植入物感染的关键问题。抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体在抵抗病原微生物的防御反应过程中产生的一类具有抗微生物活性的小分子多肽［4］。文献报道曾使用高速原子力显微镜拍摄抗菌肽作用于大肠杆菌(E.coli)的即时动态影像发现，存活的E.coli全部被抗菌肽杀死［5］。蛇毒来源的内源性抗菌多肽类物质(Cathelicidin)对许多临床耐药微生物显示了极强的体外抗菌活性，并具有极低的细胞毒性以及溶血活性(＞400 μg/mL)，同时，在高的盐浓度(1%NaCl)以及血浆存在下也保持其抗菌活性，显示了较高的临床应用前景［6］。近年来也有用非人源性抗菌肽处理导尿管抑制生物膜的动物实验研究的报道［7］，但用蛇毒来源的Cathelicidin处理人工植入物涤纶补片来抑制生物膜的动物实验研究未见报道。

本实验选用大肠埃希菌和人工植入物涤纶补片来建立家兔感染模型，并用几丁糖凝胶作为生物涂层，利用眼镜王蛇蛇毒来源的Cathelicidin(抗菌肽OH-CATH)及目前临床常用药物头孢哌酮舒巴坦进行体内实验，以探讨蛇毒OH-CATH抗菌肽应用于人工植入物涂层是否有抑菌效果，其对生物膜是否有抑制作用，并通过测定感染组织的细胞因子，来探讨局部感染是否引发免疫调节作用来实现对实验动物的保护作用。

1 材料与方法

1.1 菌液制备将液氮保存的E.coli ATCC25922菌株(菌种来自中科院昆明动物所细胞库)接种于LB培养基后37℃过夜培养，次日将菌液接种于肉汤平板37℃过夜培养获得E.coli菌落，取单个E.coli菌落接种于LB培养基37℃过夜培养后获得E.coli ATCC25922纯种菌液。

1.2 蛇毒抗菌肽OH-CATH的制备蛇毒抗菌肽OH-CATH结构简单，成熟抗菌肽由30个氨基酸残基组成，无二硫键，由吉尔生化(上海)有限公司合成，氨基酸序列为:KFFKKLKNSVKKRAKKFFKKPRVIGVSIPF，纯度＞95%。实验所用样品由中国科学院“动物模型与人类疾病机理”重点实验室“生物毒素与人类疾病”学科组提供。

1.3 兔涤纶补片感染模型制备

1.3.1 实验分组取雄性成年新西兰实验白兔24只，体重(2.5±0.2)kg，采用简单随机分组法分为4组，每组6只标记为1、2、3、4、5、6。预处理涤纶补片，将涤纶补片修剪成大小为1cm×1cm的24块方块，利用浸涂法进行处理，空白对照组(A组)涤纶补片无浸涂，几丁糖组(B组)涤纶补片浸涂几丁糖凝胶(中国石家庄亿生堂医用品有限公司)，头孢哌酮+几丁糖组(C组)涤纶补片浸涂10 mg/mL头孢哌酮几丁糖凝胶，OH-CATH抗菌肽+几丁糖组(D组)涤纶补片浸涂0.2 mg/mL蛇毒OH-CATH抗菌肽几丁糖凝胶。每次浸涂均为10 s，快速取出，保证浸涂量一致，将4组涤纶补片70℃固化1 h。

1.3.2 涤纶补片的兔模型严格按照无菌操作，在每只兔背部取4个点，每点间距大于5cm，每点皮下切一大小约1 cm×1 cm的袋装腔隙，将4种处理(A、B、C和D组)后的涤纶补片分别植入对应4组白兔的皮下，然后向腔隙内注入对数生长期E.coli ATCC25922 1 mL(约100 cfu)，缝合切口回笼饲养。

1.4 观察指标

1.4.1 细菌检测及扫描电镜观察生物膜于第7天无菌取出兔模型涤纶补片和该部位皮下组织约1g。将取出的每块涤纶补片均分为2块，一块(1.0cm×0.5cm)置入1mL LB液中洗涤后将洗涤液37℃培养16h，测定其吸光度(A)值，然后将涤纶补片置入1 mL LB液中超声振荡1 min，取100 μL振荡液接种于76 mm培养板37℃过夜培养后菌落计数;另一块经戊二醛固定后行扫描电镜观察生物膜的形成情况。

1.4.2 组织学观察及细胞因子测定取一半皮下组织(0.5 g)经4%甲醛固定后行HE染色病理检查。另一半匀浆处理后4℃1500r/min离心15 min，离心半径13.5 cm，取上清液行白细胞介素(influence，IL)-6、IL-10、IL-1α、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附法(ELISA)测定，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，分别对应加100 μL的样品稀释液、标准品和待测样品，2 h后每孔加检测溶液A工作液100 μL(稀释2倍)，1 h后洗板，每孔加检测溶液B工作液(稀释2倍)100 μL，1 h后洗板，每孔加底物溶液90 μL避光显色后每孔加终止溶液50 μL，测各孔A值。

1.5 统计学分析用SPSS 16软件进行统计分析，定量检测数据用均数±标准差(x±s)表示，多组均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两比较视方差齐性检验(以0.1作为检验水准进行Levene检验)结果进行不同的选择，当方差齐时，选择LSD检验，当方差不齐时，选择Tamhane′s T2检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌检测①A值:涤纶补片第1遍洗涤液细菌培养，测定吸光度600 nm的A值，以检测涤纶补片上的悬浮细菌数量。A组与B、C和D组比较均有统计学意义(P＜0.05)，B组与C和D组比较均有统计学意义(P＜0.05)，D组与C组比较有统计学意义(P＜0.05)，见表1。②细菌培养菌落计数:A组与B组无统计学意义(P＞0.05)，与C组和D组比有统计学意义(P＜0.05)。B组与C组和D组有统计学意义(P＜0.05)。C组与D组无显著性统计学意义(P＞0.05)。见图1。

表1 涤纶补片洗涤液细菌培养A值(x±s)Table 1 Optical density of the bacterial cultures prepared from polyester patch elutions(x±s)

图1 涤纶补片振荡液细菌培养菌落计数(n=4)Figure 1 Results of bacterial cultures prepared from polyester patch oscillating solution(n=4)

图2 各组涤纶补片扫描电镜结果Figure 2 SEM images of the polyester patches in different groups

图3 各组皮下组织HE染色病理图片Figure 3 H＆E images of the subcutaneous tissues obtained from the various polyester patches in different groups

2.2 涤纶补片扫描电镜结果A组:涤纶补片表面覆盖大量的生物膜结构，纹理不清，可见典型的E.coli附着及炎性分泌物，见图2a。B组:涤纶补片表面覆盖大量的生物膜结构，纹理不清，可见典型的E.coli附着、炎性分泌物和几丁糖凝胶，见图2b。C组:涤纶补片表面覆盖较多的生物膜结构，纹理稍清晰，见不典型的E.coli附着、较多炎性分泌物和几丁糖凝胶，见图2c。D组:涤纶补片表面覆盖的生物膜结构较少，涤纶补片的纹理清晰，未见典型及不典型的E.coli附着，可见红细胞等组织细胞，炎性分泌物较少，可见几丁糖凝胶，见图2d。

2.3 皮下组织HE染色病理检查结果A组:HE染色可见皮下局部组织坏死、大量中性粒细胞浸润，见图3a;B组:HE染色可见皮下组织明显坏死、大量中性粒细胞浸润，见图3b;C组:HE染色可见皮下组织坏死不明显，较多中性粒细胞浸润，见图3c;D组:HE染色可见皮下组织无明显坏死，较多中性粒细胞浸润，见图3d。

2.4 兔皮下组织细胞因子测定结果①TNF-α:C组显著性降低(P＜0.05)。D组显著性升高(P＜0.05)。A组和B组无统计学意义(P＞0.05)。②IL-1α:D组较其他3组显著升高，有统计学意义(P＜0.05)。③IL-6:均未检出。④IL-10:C组显著低于B组和D组，有统计学意义(P＜0.05)，A组、B组和D组之间无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 各组兔皮下组织细胞因子测定结果(x±s，pg/mL)Table 2 Results of cytokine determination in the subcutaneous tissue of different groups of rabbits(x±s，pg/mL)

3 讨论

生物膜危害大、治疗困难使其成为当今研究的热点，目前很多阻止生物膜形成的方法如缩短人工植入物的留置时间、改变植入物的表面结构、抗生素预处理植入物等均未达到效果，反而增加了感染的概率和耐药菌株的产生，甚至还导致真菌感染和严重的变态反应［8-11］。在我们的实验中，使用几丁糖凝胶与蛇毒OH-CATH抗菌肽制成人工植入物的表面涂层应用于实验动物体内，达到了良好的效果。

测定涤纶补片洗液的A值和培养振荡液发现，以空白对照组补片上的菌落数和生物膜数量最多，而OH-CATH抗菌肽+几丁糖组的菌落数和生物膜数量最少。在涤纶补片的电镜观察中发现，OH-CATH抗菌肽和头孢哌酮+几丁糖组补片上生物膜结构少，而且OH-CATH抗菌肽组的抑菌效果更明显，而空白对照组形成了厚厚的生物膜结构且有E.coli的存在。对皮下组织的病理检查进一步验证了OH-CATH抗菌肽和头孢哌酮+几丁糖组的感染程度明显轻于空白对照组。可见应用抗生素头孢哌酮和蛇毒OH-CATH抗菌肽预处理涤纶补片均达到了控制感染和预防生物膜形成的作用，但蛇毒OH-CATH抗菌肽的效果更明显。

蛇毒OH-CATH抗菌肽的抗菌机制与头孢菌素类抗生素不同，OH-CATH以其带正电的氨基酸残基附着到带负电荷的细菌细胞壁，随之疏水结构域插入质膜中，当OH-CATH达到一定浓度后聚集，以形成孔道或膜内分子间相的移位来破坏细菌细胞膜最终导致死亡［12-14］。OH-CATH有良好抗菌效果、可预防生物膜形成及不易产生耐药性等性能与其特殊的抗菌机制有关。

本实验对感染模型细胞因子的测定发现，OH-CATH抗菌肽+几丁糖组组TNF-α的表达在4组中显著升高(P＜0.05)，可能是随着感染的出现而引发的保护性免疫。而头孢哌酮+几丁糖组的IL-10表达显著降低(P＜0.05)，而IL-10可以反映感染程度。IL-6在4组中均未检出，可能的原因是兔皮下组织中其含量在检测范围以下，或者由于其表达本身的下调。IL-1α的含量OH-CATH抗菌肽+几丁糖组显著高于其他3组(P＜0.05)。可见蛇毒OH-CATH抗菌肽处理的涤纶补片置入兔体内后，引发了较强的保护性免疫，促进了TNF-α、IL-1α的升高使实验动物受到保护。头孢哌酮因其强大的杀菌效能，局部感染减轻较早，使反映感染程度的IL-10水平也随之下降。

通过兔涤纶补片感染模型的实验，我们首次成功利用几丁糖凝胶与抗生素头孢哌酮或蛇毒OH-CATH抗菌肽制成人工植入物的表面涂层应用于实验动物体内，起到了控制感染和抑制了人工植入物表面生物膜的形成的作用，同时也调节感染局部的免疫状态，实现了对实验动物的保护作用，为将来蛇毒cathelicidin抗菌肽的临床应用奠定了理论基础。

［1］林兴，黄云超，杨达宽，等.SspA对生物材料细菌黏附及生物膜形成的影响［J］.国外医学生物医学工程分册，2005，28(5):290-294.

［2］刘正武，何晓，陈进.心脏涤纶补片在髁突骨折治疗中的应用体会［J］.广西医学，2012，34(6):803-804.

［3］Lasa I，Del Pozo JL，Penadés JR，et al.Bacterial biofilms and infection［J］.An Sist Sanit Navar，2005，28(2):163-175.

［4］周继章.抗菌肽抗病的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2012，39(7):204-208.

［5］Georg EF，Roberto JB，David SG，et al.Kinetics of antimicrobial peptide activity measured on individual bacterial cells using highspeed at omic force microscopy［J］.Nature Nanotechnology，2010，5(4):280-285.

［6］Zhao H，Gan TX，Liu XD，et al.Identification and characterization of novel reptile cathelicidins from elapid snakes［J］.Peptides，2008，29(10):1685-1691.

［7］Giacometti A，Cirioni O，Ghiselli R，et al.Distinctin improves the efficacies of glycopeptides and betalactams against staphylococcal biofilm in an experimental model of central venous catheter infection［J］.J Biomed Mater Res A，2007，81(1):233-239.

［8］Ha US，Cho YH.Catheter-associated urinary tract infections:new aspects of novel urinary catheters［J］.Int J Antimicrob Agents，2006，28(6):485-490.

［9］Costerton W，Veeh R，Shirtliff M，et al.The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections［J］.J Clin Invest，2003，112(10):1466-1477.

［10］徐敏，徐榕，张优琴，等.留置导尿管与医院泌尿系感染的关系［J］.中华医院感染学杂志，2001，11(5):368-369.

［11］施德仕，邵海枫.细菌生物膜感染的研究进展［J］.医学研究生学报，2011，24(12):1319-1323.

［12］Cirioni O，Giacometti A，Ghiselli R，et al.RNAIII-inhibiting peptide significantly reduces bacterial load and enhances the effect of antibiotics in the treatment of central venous catheter-associated Staphylococcus aureus infections［J］.J Infect Dis，2006，193(2):180-186.

［13］Oren Z，Shai Y.Seleetive lysis of baeteria but not mammalian cells by diastereomers of melittin:structure-function study［J］.Biochemistry，1997，36(7):1826-1835.

［14］闫轶洁，冯占雨.抗菌肽生物活性及其致细胞死亡作用的高度选择性［J］.中国畜牧兽医，2011，38(6):222-224.