介孔二氧化硅纳米材料分散性对293T细胞凋亡的影响

田迎，滕兆刚，卢光明，郑玲

0 引言

近年来，纳米材料在医药领域的研究越来越广泛，如修饰后具有荧光或磁性性能的纳米颗粒能够用于细胞标记、示踪、造影;装载药物的介孔纳米材料可以实现药物转运及靶向治疗［1－4］。与此同时，纳米材料的生物安全性也受到关注，其大小与表面物化性质都是决定细胞毒性的重要因素［5－8］。纳米材料的分散性对于细胞凋亡的研究还未见报道。本文通过制备2种分散性不同的介孔二氧化硅纳米材料(mesoporous silica nanomaterials，MSNs)，初步探索其对人胚肾细胞系293T细胞吞噬以及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料MSN-1、MSN-2为本实验室滕兆刚博士制备合成，人胚肾细胞系293T细胞购自ATCC(American type culture collection)细胞库，DMEM培养基、青链霉素双抗溶液、胎牛血清及胰酶购自美国GIBCO公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 MSN-1、MSN-2的制备和表征MSN-1、MSN-2

分别参照文献［9－10］的方法制备。MSN-1、MSN-2利用透射电镜方法进行表征，加速电压为200 kV。首先配制0.05 g/L纳米粒的乙醇溶液，超声分散均匀后，滴于覆盖有膜的铜网上，真空干燥后，于Hitachi H-8100型透射电子显微镜下拍摄，观察纳米粒的尺寸及分散性。

1.2.2 细胞培养293T细胞于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，37℃、5%CO2培养箱中孵育，每48h传代1次。

1.2.3 透射电镜观察293T细胞对MSN-1、MSN-2的摄取待293T细胞汇合度达70%时，分别加入混合均匀的MSN-1、MSN-2，使其终浓度为100 μg/mL，孵育24 h，清洗消化，收集细胞，用2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定1 h，丙酮脱水，Epon-812树脂包埋，45～65℃聚合48h，半薄切片定位，70nm超薄切片，醋酸铀—柠檬酸铅双重电子染色，JEM-1011型透射电镜观察细胞对材料的吞噬结果。

1.2.4 流式细胞仪分析MSN-1、MSN-2对293T细胞凋亡的影响将细胞接种于6孔板上，每孔细胞数量约5×105，待细胞贴壁且达到70%汇合度时，分别加入浓度为0(对照)、100、150、200和250 μg/mL的MSN-1、MSN-2，每个浓度设3个孔。培养箱孵育24 h，PBS洗涤收集细胞，分别加入500 μL的Binding buffer、5 μL的Annexin V-FITC、5 μL Propidium Iodide，混匀，室温避光反应15 min，流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=530 nm。具体操作参照试剂盒说明书。

1.3 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行数据处理。定量结果以均数±标准差(x±s)表示。2组间的均数比较采用独立样本t检验，组间方差不齐(以0.1作为检验水准进行Levene检验)时采用Satterthwaite校正t检验。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 透射电镜观察MSN-1和MSN-2的尺寸及分散性MSN-1、MSN-2制备后装入容器，待沉淀后观察，MSN-2均匀分散在溶液中，MSN-1见分层，见图1a。进一步分析透射电镜结果，2种纳米粒呈球状，尺寸均在100 nm左右;MSN-1颗粒之间有连接，见图1b，MSN-2分散性较好，与图1a结果一致，见图1c。

2.2 人胚肾细胞系293T细胞吞噬纳米粒MSN-1和MSN-2293T细胞培养状态良好，见图2a;通过透射电镜观察293T细胞对MSN-1和MSN-2这2种材料均有摄取，计数结果显示大约10%的纳米粒被细胞吞噬;因MSN-1颗粒之间有连接，进入细胞后成团聚状，见图2c;MSN-2颗粒在细胞中分散性也相对明显，见图2d。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡结果不同浓度梯度的MSN-1，MSN-2(0、100、150、200和250 μg/mL)与293T细胞共同孵育24 h，流式细胞仪检测结果显示与对照(0 μg/mL)浓度比较，100、150、200和250 μg/mL的MSN-1对293T细胞的影响差异有统计学意义(P＜0.05);MSN-2组并未引起明显的细胞凋亡反应，见图3，表1。

表1 MSNs对293T细胞凋亡的影响(x±s，%)Table 1 The cell apoptosis of 293T impacted by the two MSNs(x±s，%)

图1 静置状态与透射电镜下观察MSNs的分散性Figure 1 The dispersion of two MSNs by transmission electron microscopy and after precipitation

图2 透射电镜观察人胚肾细胞系293T对2种MSNs的摄取Figure 2 The human embryonic kidney cell 293T and the phagocytosis to the two MSNs by transmission electron microscopy

图3 流式细胞仪检测不同浓度的MSNs影响细胞凋亡的结果Figure 3 The cell apoptosis results induced by MSNs with different concentration by flow cytometer

3 讨论

由于介孔纳米材料具有规则的孔径结构和较大的表面积，有利于反应物的扩散，并能在孔道内装载药物，从而实现疾病的靶向治疗，在生物医学等领域显示出重要的应用前景［11－13］。随着介孔材料研究的深入和应用的推广，其生物安全性成为目前关注的热点。介孔材料的大小、结构、分散性及表面性质等理化因素均有可能影响细胞骨架和细胞核的完整性与稳定性，影响细胞某些生物学功能，导致细胞的凋亡反应［14－16］。

本文主要研究2种分散性不同的MSNs对人正常细胞系如人胚肾细胞系293T细胞的影响，考察其对细胞的吞噬和凋亡，为接下来的载药治疗提供研究基础。透射电镜的结果表明，2种MSNs的分散性不同，仍有大约10%的材料进入细胞，被溶酶体包被;同时分散性也影响材料在细胞中的状态，分散性好的材料进入细胞后仍有良好的分散性，颗粒状明显，分散性差的材料进入细胞后成团聚状态。凋亡是一种程序性的、正常的细胞死亡，本实验利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测不同浓度梯度下2种MSNs对293T细胞凋亡的影响，结果显示分散性不佳的材料MSN-1随着孵育浓度的增加，引起293T细胞的凋亡，分析原因可能由于材料进入细胞后成团聚状态，导致自噬泡局部浓度过高，与溶酶体结合后，降解胞内大分子或细胞器，过度的自噬引起细胞凋亡［17］。而MSN-2分散性较好，并未引起明显的凋亡反应，提示此材料在胞内浓度达到250 μg/mL时不会引起细胞明显的毒性反应。

总之，阐明纳米材料的生物安全性，并合理设计和优化材料的功能结构才能拓展其在生物、医药方面的研究，实现向临床应用等跨学科领域的转换，显示其重要的价值。

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