宁夏啮齿动物DNA条形码分析

张 涛,宁文艳,吴建华,刘京利,乔富贵,李贵昌,鲁 亮,刘起勇,李 丽,赵建华

宁夏地处黄河中上游，跨东部季风和西北干旱区域，北部被腾格里沙漠、乌兰布和沙漠、毛乌素沙漠地环绕，南部有黄土高原插入，地处我国三大自然区域的交会和过渡地带。虽然是我国大陆面积最小的省份之一，但由于南部六盘山山脉和西北部贺兰山山脉的存在，使其境内具有丰富多样的自然环境。从南往北，宁夏的生态环境涵盖了西北地区所有的生态类型，有草原、森林、荒漠、湿地、农田等截然不同的自然环境。在这多样的生态环境中，形成了啮齿动物种类的多样性。宁夏记录的啮齿动物有38种，其中兔形目3种，啮齿目35种[1]，仅仓鼠科就达16种。丰富的啮齿动物种群，也造成宁夏具有多种鼠传疾病的自然疫源地。宁夏东北部属于内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫疫源地[2]，西南部的海原、西吉则属于甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地[3]，南部的六盘山南麓则存在姬鼠型的流行性出血热自然疫源地[4]。同时宁夏中部和南部还是包虫病的流行区[5]，鼠类在包虫病原的保存和传播中起到了非常重要的作用。

因此，啮齿动物的准确分类和科学防治是宁夏多种重要传染病预防和控制的关键。为了提高宁夏各级专业人员啮齿动物分类鉴定水平，我们在宁夏各地采集啮齿动物标本，并获得了这些标本的DNA条形码，一方面可以更准确的对这些啮齿动物进行分类，也为以后利用DNA条形码技术对啮齿动物进行鉴定提供基础资料。

1 材料和方法

1.1标本采集 2013年分别在宁夏贺兰山、银川月牙湖、灵武、海原、西吉、盐池和泾源等地的不同生境采集啮齿动物标本154份。经外部形态鉴定有19种(详见表1)。

表1 啮齿动物形态鉴定结果及采集地区信息

1.2DNA提取 使用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取肝脏或肌肉总DNA，4 ℃保存备用。

1.3PCR扩增与测序 扩增时首先选用下列通用引物[6]扩增线粒体COI基因片段。当通用引物扩增反应失败时，则选用Ivanova等[7]设计的鸡尾酒引物(引物序列见表2)。PCR 反应扩增体系：10×缓冲液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，引物各0.5 μL，LA Taq酶0.15 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR 反应条件为: 95 ℃预变性5 min， 95 ℃变性45 s， 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环，最后再72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，送测序公司进行双向测序。

表2 PCR扩增COI基因的相关引物序列

1.4DNA序列分析 首先用DNAstar中的Seqman进行序列拼接。然后用Clustal W[7]软件进行多重序列比对，并进行适当的手工调整。同时将测定的序列在NCBI网站上运行BLAST[8]程序进行序列同源性比较，以确保所获得的序列是目标序列。同时将BLAST结果中相似度大于95%的，或相似度最大的近缘种的序列也用于系统树构建，用于判断形态鉴定的准确性。

1.5构建系统树 运用Mega5[9]软件分析各基因序列的碱基组成和变异，基于Kimura-2-parameter(K2P)[10]模型的遗传距离。采用邻接法构建全部COI基因序列的Neighbor Joining树。

2 结 果

154份现场采集的标本中，通过通用引物和鸡尾酒引物共扩增得到129条序列，成功率为84%。扩增片段的长度符合引物设计的预期，并经过BLAST比对后确认为线粒体COI基因片段。

将这些片段排列整齐后构建Neighbor-Joint 树，形成20个具有高支持度的分支(不包括达乌尔黄鼠)，提示这些个体由20个有效的种类构成(图1)，和形态学鉴定的种类数量基本一致。从盐池县采集的1只黑线仓鼠和从灵武市采集1只黑线仓鼠形成了两个分支，其中盐池县的黑线仓鼠与GenBank中的中国仓鼠(Cricetulusgriseus)的相应序列具有99%的相似性，因此被修订为中国仓鼠，而在GenBank中没有与灵武市黑线仓鼠的COI序列相似的序列，我们还是以黑线仓鼠命名。与贺兰山鼠兔相似度最高的是褐斑鼠兔(Ochotonapallasi)，相似度为96%。与阿拉善黄鼠相似度最高的是达乌尔黄鼠，相似度为92%。与长爪沙鼠相似度最高的是子午沙鼠，相似度只有88%，说明GenBank中没有长爪沙鼠的相关序列。其他种类个体的BLAST结果都与形态学鉴定结果一致，证明形态学鉴定结果是基本准确的。

在所有确定为一个鼠种的分支中，除了花鼠的分支内遗传距离较大外(7.5%)，其他分支内遗传距离最大为三趾跳鼠分支的3.2%。中国仓鼠与黑线仓鼠的分支间遗传距离11.6，贺兰山鼠兔与褐斑鼠兔间遗传距离为3.6%(详见图1)。

图1 宁夏不同地区啮齿动物COI基因序列Neighbor Joining树

3 讨 论

本次调查比较系统地采集了宁夏南部六盘山、贺兰山、东部草原、半荒漠草原和黄土高原(南华山和月亮山)地区的常见鼠种，而沙漠地区稀有鼠种都没有捕获，有待以后进一步进行调查。

宁夏存在两种不同类型鼠疫自然疫源地，宁夏南部黄土高原的阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地和东部荒漠草原的长爪沙鼠自然疫源地。黄鼠在宁夏广泛分布，一般将东部荒漠草原捕获的黄鼠定名为达乌尔黄鼠，南部黄土高原捕获的黄鼠定名为阿拉善黄鼠。在宁夏鼠疫疫源地宿主动物监测中，常常面临阿拉善黄鼠与达乌尔黄鼠的分类鉴定问题。基于形态特征的分类方法无法准确区分阿拉善黄鼠和达乌尔黄鼠，因而，阿拉善黄鼠长期以来一直被定为达乌尔黄鼠的一个亚种。但通过染色体核型的研究，逐渐发现典型的达乌尔黄鼠和一些阿拉善黄鼠存在染色体数量的差异，因此现在认为达乌尔黄鼠的二倍体染色体2n=36，而阿拉善黄鼠的二倍体染色体2n=38[11]。本研究首次在阿拉善黄鼠鼠疫疫源地分析了当地黄鼠的DNA条形码序列，并与GenBank中达乌尔黄鼠的DNA条形码进行了比对和系统关系分析，确定两者之DNA条形码的遗传距离达到8%，达到了DNA条形码公认的种间的遗传距离。因此，从分子遗传学的角度证明了阿拉善黄鼠和达乌尔黄鼠是两个独立种的关系。下一步需要进一步确认这两种黄鼠的分布界限问题。阿拉善黄鼠的分布范围是否就是原来达乌尔黄鼠阿拉善亚种的分布范围还需要通过大量标本的调查才能确定。由于宁夏独特的地理环境，使仓鼠种群得到了很好的进化和发展，已发现16种之多[1]。监测中仓鼠间种群的鉴定，存在不少的疑虑，特别是幼鼠。黑线仓鼠是我国华北地区比较常见的仓鼠种类。不少个体由于背上黑线不是很明显，当捕获标本沾水受潮时，黑线更不易察觉，因此，容易被误定为灰仓鼠。这次在宁武临河监测点捕获的黑线仓鼠标本在沾水的情况下就很难确定到底是黑线仓鼠还是灰仓鼠。通过DNA条形码的使用，更正了形态学鉴定可能的错误。

我国的相关文献至今只记录黑线仓鼠一种[11-12]，但有人通过染色体特征分析，认为北部有黑色纵纹的仓鼠应该分为3种，即黑线仓鼠Cricetulusbarabensis，中国仓鼠Cricetulusgriseus，和拟黝仓鼠Cricetuluspseudogriseus。但由于这个结果没有被后人证实，所以这3个种是否成立还存在疑问[11, 13]。虽然在形态上中国仓鼠被认为是黑线仓鼠的一个亚种，但GenBank中中国仓鼠的DNA条形码与宁夏黑线仓鼠的遗传距离达到6%，很可能是两个独立的物种。因此关于黑线仓鼠是否存在形态学隐种的问题还有待进一步研究。当然在仓鼠鉴定过程中，如果能参考头骨的形态及测量数据，将更具科学性，但无疑增加了工作量。

分布于宁夏贺兰山一带的鼠兔一直以来被认为是高山鼠兔的一个亚种。但近来被认为是一个独立的种：贺兰山鼠兔[11]。而本次调查在贺兰山获得的鼠兔，其DNA条形码则与褐斑鼠兔的DNA条形码遗传距离比较接近，只有不到4%的差异。因此我们暂时将该份标本定位褐斑鼠兔。至于贺兰山地区是否存在两个不同的鼠兔种类，还有待进一步的调查。

黑线姬鼠在宁夏是流行性出血热的重要宿主，主要分布于宁夏南部的六盘山山区。因此宁夏南部也是宁夏流行性出血热的主要流行地区。随着我国山区退耕还林政策的执行，宁夏中部和南部山区的植被情况在过去的十年中得到很大改善。因此，黑线姬鼠的分布范围也逐渐从宁夏南部的局部地区向北部逐渐扩散。本次调查在六盘山外围的西吉县火石寨旅游景区及农田中捕获了为数不少的黑线姬鼠，而且在海原县南华山也捕获到许多。因此，有必要对宁夏六盘山外围地区黑线姬鼠的分布范围和密度进行有效的监测，对高密度地区并做好流行性出血热的健康宣传工作，预防流行性出血热在当地出现暴发流行。

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