TLR7在结核分枝杆菌感染中的作用研究

李瑞芳,管志玉,付玉荣,伊正君

很多研究已经发现，TLR7会增强宿主抗感染免疫应答能力。在感染早期，TLR7可以通过诱导细胞因子的分泌来增强机体快速地对病原体感染做出全身性免疫应答[1]，以有助于清除细菌、病毒的感染[2-3]。ssRNA作为TLR7的配体，可以有效的激活TLR7，刺激免疫细胞表达TLR7增强细胞免疫应答。Monica A Delgado指出，卡介苗(BCG)感染巨噬细胞后，用TLR7配体咪喹莫特或ssRNA治疗细胞或使细胞饥饿后，显示TLR7能通过诱导自噬减少胞内BCG。但是，在结核分枝杆菌感染中TLR7的作用至今未有报道。本研究以小鼠巨噬细胞为模型，结核分枝杆菌感染后加入化学合成的TLR7激活基序ssRNA激活TLR7，研究TLR7在结核分枝杆菌感染中的影响，以期能为结核分枝杆菌的防治提供帮助。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株 小鼠巨噬细胞RAW264.7，潍坊医学院医学免疫学实验室惠赠。

1.1.2主要试剂 RPMI 1640培养基(GBICO公司)；胎牛血清(GBICO公司)；罗氏培养基(实验室自配)；ssRNA(本实验室构建)；异烟肼；胰酶；磷酸盐缓冲液PBS(实验室自配)；小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠IFN-γ ELISA试剂盒、小鼠IL-4 ELISA试剂盒、小鼠IL-12 ELISA试剂盒(北京达科为生物科技有限公司)；结核杆菌(TB)核酸测定试剂盒(上海之江生物科技有限公司)，所用试剂均为国产分析纯。

1.1.3实验仪器 Fax-2100型酶标仪，倒置显微镜(Olympus公司)，Thermo型CO2培养箱，HHB114-20型恒温培养箱，Sirion200型扫描电镜(FEI公司)。

1.2方法

1.2.1TLR7对结核分枝杆菌吞噬率的影响 细胞用完全1640培养基稀释至3×105/mL，2 mL /孔加入24孔板，37 ℃ 5% CO2培养箱过夜培养至细胞牢固贴壁，次日，用新鲜的完全1640培养基换液，1 mL /孔。实验细菌接种于罗氏平板，37 ℃恒温培养约15 d，挑取单个菌落进行研磨，0.9%生理盐水反复淘洗后自然沉淀3次，取上清，调整细菌浓度至1.5×108/ mL，沉淀及所有用具高压灭菌后丢弃。取20 μL/孔加入细胞上清中。细胞分组处理，每组重复3孔。处理如下：感染后未激活组、感染后加入ssRNA组(20 μL/孔，终浓度10 μg/mL)、饥饿组(即感染前用无血清1640培养基换液)、感染后加入异烟肼组(20 μL/孔，终浓度10 μg/mL)。处理后于37 ℃ 5% CO2培养箱培养。收集感染后0 h、1 h、3 h、5 h细胞上清，煮沸后离心取上清液进行荧光定量PCR检测。定量PCR反应体系如下：36 μLTB核酸荧光PCR检测混合液(含有dNTP、1对引物和1条荧光探针的溶液)，0.4 μL酶(Tag+UNG)，4 μL细胞上清。反应体系按下列参数进行：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循环40次，单点荧光检测在60 ℃，荧光通道检测选择FAM通道。

1.2.2TLR7对结核分枝杆菌感染细胞作用的形态学观察 取5×106个细胞，200 mL细胞培养瓶内过夜培养，感染3 h后加入50 μL ssRNA(终浓度10 μg/mL)，同时设立感染后未激活对照和未感染正常细胞对照，细胞于37 ℃ 5% CO2培养箱培养3 h。扫描电镜观察细胞形态，步骤如下：细胞用0.3%胰酶消化，离心，取细胞沉淀用1 mL 0.01 mol/L pH7.4 无菌PBS重悬后移入1.5 mL EP管，离心；加入0.5 mL 4 ℃预冷3%戊二醛预固定，上清吸弃，加1 mL 预冷3%戊二醛，4 ℃过夜。然后经脱水、浸透、包埋聚合、切片(厚度为70 nm)及染色，最后扫描电镜观察。

1.2.3TLR7对杀菌活性的影响 细胞过夜培养，次日换液，细菌感染3 h后分组处理(分组同1.2.1 TLR7对结核分枝杆菌吞噬率的影响)，每组重复3次，37 ℃ 5% CO2培养箱孵育36 h，收集细胞上清冻存于-80 ℃备用，细胞用无菌1% Tritonx-100裂解，500 μL/孔，完全裂解后，吹打混匀，0.01 mol/L pH7.4 无菌PBS 1∶20稀释，取100 μL菌液涂于罗氏平板。37 ℃恒温培养19 d后菌落计数。

1.2.4TLR7对结核分枝杆菌感染细胞作用的细胞因子影响 细胞于24孔板过夜培养，6×105/孔，次日换液，细菌感染3 h后分组处理(分组同1.2.1 TLR7对结核分枝杆菌吞噬率的影响)，37 ℃ 5% CO2培养箱培养36 h、48 h，收集细胞上清。按试剂盒说明操作，分别检测细胞上清中IL-12、IL-4与TNF-α的含量。

2 结 果

2.1TLR7对结核分枝杆菌吞噬率的影响 RT-PCR法检测不同时间感染后4个组的细胞上清结果显示，4组均在感染后3 h CT值最高(P>0.05)，即细胞上清中细菌浓度最低，而感染5 h后CT值均略有下降，因此以下试验均选定感染时间为3 h。如图1所示。

2.2TLR7对结核分枝杆菌感染细胞作用的形态学测定 治疗3 h后扫描电镜观察，正常细胞加入TLR7激活基序ssRNA后细胞形态未发生变化，结构完整，胞核边缘整齐，线粒体清晰(图2，D)，与正常细胞比较(图2，A)无显著变化；感染后加入TLR7激活基序ssRNA治疗组感染组比较线粒体相对清晰，吞噬小泡明显增多(图2，C)，而感染组细胞出现较多的细胞碎片，线粒体不清晰(图2，B)。

图1 TLR7对结核分枝杆菌吞噬率的影响

图2 扫描电镜观察不同处理下的细胞形态变化

2.3TLR7对杀菌活性的影响 感染细胞用不同方法处理后，细胞经1%Tritonx-100无菌裂解于罗氏培养基培养后活菌落计数显示，加异烟肼处理后菌落数量最少(P>0.05)，而ssRNA组菌落数量与异烟肼组差别不大(P>0.05)，但是与感染组相比明显减少(P<0.05)。结果见图3所示。

图3 TLR7对杀菌活性的影响

2.4TLR7对结核分枝杆菌感染细胞的细胞因子影响 感染3 h后用不同方法处理细胞检测细胞上清中的IL-12、IL-4与TNF-α的含量，结果显示，与感染组比较，处理36 h后，ssRNA组IL-12(P<0.05)、IL-4(P<0.05)上升，处理48 h后IL-4(P< 0.05)下降，TNF-α的含量上升(P<0.05)；异烟肼组在处理48 h后显示IL-4(P< 0.05)下降、IL-12(P<0.05)上升。结果见图4所示。

3 讨 论

结核分枝杆菌是胞内感染菌[4]，感染宿主后巨噬细胞在防御方面起重要作用，是结核分枝杆菌入侵宿主后侵入的首要细胞。巨噬细胞表达TLRs识别病原体并且通过诱导自噬等机制清除胞内病原体[5]。卡介苗(BCG)感染巨噬细胞后，用TLR7配体咪喹莫特或ssRNA治疗细胞或使细胞饥饿后，显示TLR7能通过诱导自噬减少胞内BCG。核酸样结构是尽人皆知的TLR7/8配体，ssRNA可以有效的激活TLR7，ssRNA作为TLR7激动剂可以发展成作为诱导细胞免疫应答的佐剂[6-7]。本文选用小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞作为细胞模型，加入本实验前期构建TLR7激活基序ssRNA检测TLR7在结核分枝杆菌感染中的杀菌作用。巨噬细胞有吞噬能力，但何时吞噬作用最强还未知，本实验设定3个感染时间段1 h、3 h、5 h，定量PCR法检测细胞上清中的细菌数量，重复3次，取平均值。实验设定4组，分别为感染后未激活对照组(以下简称感染组)、感染后加ssRNA组(以下简称ssRNA组)、饥饿组、感染后加异烟肼组(以下简称异烟肼组)。结果显示，细胞吞噬细菌后每组CT3 h值均高于CT1 h值和CT5 h值(P>0.05)，说明实验设定的3个时间段，3 h时吞噬能力最强，因此下步实验均选定感染时间为3 h。另外，从CT3 h值-CT1 h值结果看，差值最大的为ssRNA组，其次为感染组、异烟肼组、饥饿组，由此证明ssRNA组吞噬能力较强，说明TLR7有增强细胞吞噬细菌的能力。从CT5 h值看，每组CT值均下降，细胞状态也不如感染后3 h，可能感染细菌浓度偏高造成细胞裂解或其他原因使得细菌片段又释放入上清中；而ssRNA组CT5 h值高于其他组，细胞状态也好于其他组，这可能与ssRNA激活TLR7有抑制细胞坏死或凋亡的作用，而后期的扫描电镜实验也证明ssRNA组细胞状态明显好于感染组，两次实验结果相符。电镜观察自噬小体表明，治疗3 h后，ssRNA组细胞形态明显好于感染组，而且吞噬小泡增多，并且有多个细胞显示细胞处于分裂状态，这是否显示TLR7能促进细胞分裂也未可知，而且未感染加ssRNA对照组细胞状态与正常细胞无差别，说明TLR7激活基序ssRNA对细胞没有不良刺激，结果表明，TLR7是可以通过自噬机制杀灭结核分枝杆菌的。为了进一步研究TLR7是否有杀菌的能力，本实验将细胞感染后用不同方法处理，最后裂解细胞计数胞内活菌数量。经培养后菌落计数显示，用不同方法处理细胞36 h后，细胞内活菌数量最低的为异烟肼组(P>0.05)，其次是ssRNA组、饥饿组、感染对照组，此结果证明TLR7确实能增强细胞杀结核分枝杆菌的能力。虽然异烟肼组和ssRNA组菌落数量均明显低于感染对照组，但是菌落数量还是偏多，这可能是由于本实验加入的药量偏低并且处理时间偏短的原因。

图4 TLR7对结核分枝杆菌感染细胞的细胞因子影响

TLR7刺激树突状细胞和巨噬细胞的炎症应答，增强CD8+T细胞的细胞溶解活性，可通过刺激自噬、产生NO、诱导产生趋化型细胞因子等清除微生物。本实验已证明TLR7能清除胞内结核分枝杆菌，但TLR7的杀结核分枝杆菌机理此前还未知。为揭示TLR7清除结核分枝杆菌的机理，本实验继续从细胞的免疫机理来研究。从检测细胞因子看，ssRNA组IL-12(P<0.05)、TNF-α(P<0.05)、IL-4(P<0.05)的含量在不同时间点高于感染组，从结果看，TLR7还可以通过调节细胞因子杀菌。研究结果提示，TLR7确实有增强细胞杀结核杆菌的能力，可以通过刺激细胞产生自噬体和调节细胞因子产生等机制清除胞内结核分枝杆菌，而激活基序ssRNA是否可以通过抑制细胞坏死或凋亡以维持细胞生存还需要继续研究。本实验室构建的TLR7激活基序ssRNA可以用于治疗结核分枝杆菌，具体治疗方案还需要继续研究，后期研究期望能为结核分枝杆菌的治疗找到新的突破点，也为临床用药提供理论依据。

参考文献：

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