基于psbA-trnH序列变异分析川明参属亲缘关系及分类地位

宋春凤， 吴宝成， 周 伟， 刘启新

〔江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园), 江苏 南京 210014〕

在国产伞形科(Apiaceae)植物中有2个中国特有单种属：一是川明参属(ChuanminshenSheh et Shan)，隶属于前胡族(Trib. Peucedaneae)，仅有川明参(C.violaceumSheh et Shan)1种，分布于四川；二是明党参属(ChangiumH. Wolff)，隶属于美味芹族(Trib. Smyrnieae)，属下种类为明党参(C.smyrnioidesH. Wolff)，分布区域从与四川接壤的湖北一直向东分布至江西、安徽、江苏和浙江等省。这2个种不仅分布区域上有交接，而且根、茎和叶等外部形态特征非常相似，生长习性、花期以及药材功效等也十分相近，在民间曾被混作为药材 “明党参”入药[1-3]。

川明参与明党参分属于不同族，主要因为二者的果实特征差异明显，前者分生果背腹面明显扁压，被置于前胡族中；而后者分生果横切面近圆形，被置于美味芹族中[4]。邱英雄等[5]和陶晓瑜等[6]基于ISSR标记以及核基因ITS序列的研究，认为川明参属应置于美味芹族并靠近明党参属。这一建议与川明参属在经典分类中原有的系统位置分歧较大。但要最终确定川明参属的系统分类地位，还需要多学科的研究证据以及补充更多的基因片段资料。

在众多的适宜于研究物种进化的基因中，叶绿体基因psbA-trnH片段是进化速率最快的叶绿体DNA间隔区之一[7-12]，被广泛应用于被子植物分子系统树构建及物种鉴别[8-11]。

作者对川明参属的psbA-trnH片段进行克隆测序，并选取前胡族和美味芹族的代表类群(包括明党参)、以针果芹族(Trib. Scandicineae)种类为外类群，基于psbA-trnH片段序列构建系统发育树；结合外部形态和内部解剖结构，探讨川明参与明党参间及其与前胡族和美味芹族种类间的亲缘关系，为川明参属分类地位的确定提供分子系统学研究证据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试川明参、明党参、华中前胡(PeucedanummedicumDunn)和泰山前胡〔P.wawrae(H. Wolff) Su〕以及宝兴棱子芹(PleurospermumdavidiiFranch.)、丽江棱子芹(P.foetensFranch.)和鸡冠棱子芹(P.cristatumde Boiss.)的幼嫩叶片于2009年至2010年采自野外，采集地点及凭证标本信息见表1；每份样品3～5枚叶片，用硅胶迅速干燥后供试。研究涉及15个种类，包括美味芹族的5属7种、前胡族5属7种以及针果芹族1种，除前述7种外，另8个种类的psbA-trnH序列均引自GenBank。

1.2 实验方法

1.2.1 总DNA提取 采用改良的2×CTAB法[13]提取基因组总DNA，并用质量体积分数1.2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下通过Tanon 2500型凝胶成像系统测定DNA浓度。将获得的总DNA稀释20倍后作为模板用于PCR 扩增。

1.2.2 扩增与纯化 采用Sang等[14]和Tate等[15]设计的通用引物trnH(CGCGCATGGTGGATTCACAATC)和psbA(GTTATGCATGAACGTAATGCTC)进行PCR扩增。

表1 川明参和供试伞形科相关种类的凭证标本信息

首先采用20 μL反应体系进行预扩增，检测之后再将扩增体系总体积增加到80 μL。20 μL反应体系包括：10×TaqBuffer 2 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，2 mmol·L-1上、下游引物各2 μL，重蒸水9.2 μL，模板DNA 0.8 μL和TaqDNA聚合酶0.15 μL。

用MG96G 型PCR仪(Long Gene公司)进行PCR扩增反应。扩增程序为：94 ℃预变性3 min；然后于94 ℃变性1 min、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，重复循环30次；最后于72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。扩增产物经质量体积分数0.8%琼脂糖凝胶电泳后，用Tanon 2500图像分析仪观察。反应产物采用Axygen凝胶纯化试剂盒进行纯化。

1.2.3 测序 PCR 产物纯化后直接用ABI 3730型基因分析仪测序，由华大基因科技有限公司完成。

1.3 数据分析

采用Sequencher 4.5软件对获得的序列进行校正，然后用BioEdit 7.0.4.1软件进行比对和对位排列[16]并手工校正。用MEGA 5.05软件将排序后的序列组成数据矩阵，统计各种类的GC含量及变异位点和信息位点；根据Kimura 2-parameter法计算各种类间的相对遗传距离[17]。将序列格式转换为Nexus格式，碱基处理作Fitch性状(无序)、空位(gap)作缺失(missing)状态分析，利用PAUP4.0 beta 10 win软件进行统计和分支分析[18]，构建最大似然法(ML)与最大简约法(MP)系统发育树，并用自展法(bootstrap)对系统发育树进行检测，自展重复次数1 000次。最后用MrBayes V3.1.2中的贝叶斯方法构建BI系统发育树。构建ML和BI系统树前，先用Modeltest 3.7软件选择碱基替换模型并估计相关参数；经运算，获得最适的碱基替换模型为K81uf+G，相关参数为：-lnL=2 037.089 6，K=6； 碱基A、 C、 G和T的频率分别为 0.348 0、0.132 9、0.167 5和0.351 7。

2 结果和分析

2.1 供试种类的psbA-trnH长度与GC含量比较

从川明参以及明党参、华中前胡、泰山前胡、宝兴棱子芹、丽江棱子芹和鸡冠棱子芹7个种类的cpDNA中克隆获得psbA-trnH 片段并测序，各种类的psbA-trnH 片段序列已提交至GenBank；各种类psbA-trnH 片段的GenBank登录号依次为KF557756、KF557757、 KF557758、KF557759、KF557760、KF557761和KF557762(表2)。

校正后川明参和明党参的psbA-trnH片段长度均为258 bp(表2)，其余种类的psbA-trnH片段长度为228～405 bp，各种类psbA-trnH片段长度均存在差异。人工排序后psbA-trnH 片段序列总长度为553 bp(包括空位)；其中，变异位点237个，占位点总数的42.9%；信息位点178个，占位点总数的32.2%。

由表2可见：川明参和明党参psbA-trnH片段的GC含量均为23%，其他种类的为26%～35%。川明参和明党参psbA-trnH片段的GC含量最低，主要原因是它们的psbA-trnH片段序列包含多个A和T的重复序列。 由于每个种类DNA的GC含量恒定，不会因环境条件和培养条件等因子的变化而改变，且在同属不同种间DNA的GC含量差异不大，因此可利用GC含量研究种间或属间的亲缘关系及其远近程度。

根据psbA-trnH片段长度和GC含量可以得出2个明确结果：一是在选取的植物种类中psbA-trnH片段可提供的变异位点和信息位点较多，说明在伞形科的族间和属间的系统发育重建研究中psbA-trnH片段可以提供较丰富的变异信息；二是川明参的psbA-trnH片段长度及GC含量均与明党参相同，说明二者可能具有较近的亲缘关系。

表2 川明参和供试伞形科相关种类的psbA-trnH片段序列长度、GC含量和GenBank登录号

2.2 供试种类相对遗传距离分析

基于psbA-trnH片段序列计算15个供试种类间的相对遗传距离，结果见表3。川明参与属于前胡族的前胡属(PeucedanumLinn.)种类华中前胡和泰山前胡，阿魏属(FerulaLinn.)种类草地阿魏(F.kingdon-wardiiH. Wolff)，大瓣芹属(SemenoviaRegel et Herder)种类密毛大瓣芹〔S.pimpinelloides(Nevski) Manden.〕及当归属(AngelicaLinn.)种类白芷(A.dahuricaBenth. et Hook.)和狭叶当归(A.anomalaAve-Lall.)间的相对遗传距离均超过1，而与属于美味芹族的明党参、棱子芹属(PleurospermumHoffm.)种类宝兴棱子芹和丽江棱子芹及鸡冠棱子芹、舟瓣芹属(SinolimprichtiaH. Wolff)种类舟瓣芹(S.alpineH. Wolff)、羌活属(Notopterygiumde Boiss.)种类宽叶羌活(N.franchetiiC.T. Ting ex H.T. Chang)和瘤果芹属(TrachydiumLindl.)种类瘤果芹(T.royleiLindl.)间的相对遗传距离均小于0.12。说明川明参与供试前胡族各种类间的亲缘关系较远，而与美味芹族各种类间的亲缘关系则较近。

表3 基于psbA-trnH片段序列的川明参和明党参与供试伞形科相关种类间的相对遗传距离

此外，川明参与明党参的相对遗传距离仅为0.02，甚至与某些同属种类间的相对遗传距离相同，如棱子芹属宝兴棱子芹、丽江棱子芹和鸡冠棱子芹3种之间的相对遗传距离也为0.02，说明川明参与明党参间具有极近的亲缘关系。但要判断川明参与明党参能否归为同属则仍需多学科的研究证据加以验证。

2.3 供试种类分子系统发育树的比较和分析

以刺果芹〔Turgenialatifolia(Linn.) Hoffm.〕作为外类群，根据测序所得的psbA-trnH片段序列，分别构建MP、ML以及BI系统树，结果见图1、图2和图3。结果显示：3类系统树在拓扑结构上稍有区别。除去外类群，MP系统树分为2大支：一大支(Ⅰ)由川明参、明党参以及美味芹族的舟瓣芹、宽叶羌活、3个棱子芹属种类和瘤果芹构成(美味芹族分支)；另一大支(Ⅱ)由前胡族的草地阿魏、2个前胡属种类、密毛大瓣芹和2个当归属种类构成(前胡族分支)(图1)。但在ML和BI系统树中，草地阿魏独立出来并位于系统树基部，与前胡族和美味芹族分支成为姐妹类群；除去个别小分支的拓扑结构不同之外，ML和BI系统树的大分支结构与MP系统树基本相同，来自美味芹族的种类聚为一支(Ⅰ)，而前胡族种类聚为另一支(Ⅱ)(图2和图3)。ML和BI系统树的拓扑结构比较相似，大的分支结构基本相同，仅美味芹族分支中舟瓣芹和宽叶羌活的位置有所变化，前胡族分支中密毛大瓣芹的位置也稍有不同。

美味芹族分支又可分成多个小支。川明参与明党参聚为1个小支；棱子芹属的3个种类与瘤果芹组成1个小支；舟瓣芹的位置变化较大，在MP和BI系统树中均与川明参聚在同一个分支，但在ML系统树中却位于美味芹族分支的最外部；而宽叶羌活的位置也稍有变化，在MP和ML系统树上均与川明参聚为同一个分支，但在BI系统树上却与棱子芹属种类聚为同一分支。

1. 川明参 Chuanminshen violaceum Sheh et Shan； 2. 明党参 Changium smyrnioides H. Wolff; 3. 舟瓣芹 Sinolimprichtia alpine H. Wolff; 4. 华中前胡 Peucedanum medicum Dunn; 5. 泰山前胡 Peucedanum wawrae (H. Wolff) Su; 6. 宝兴棱子芹 Pleurospermum davidii Franch.; 7. 丽江棱子芹 Pleurospermum foetens Franch.; 8. 鸡冠棱子芹 Pleurospermum cristatum de Boiss.; 9. 瘤果芹 Trachydium roylei Lindl.; 10. 宽叶羌活 Notopterygium franchetii C.T. Ting ex H.T. Chang; 11. 草地阿魏 Ferula kingdon-wardii H. Wolff; 12. 密毛大瓣芹 Semenovia pimpinelloides (Nevski) Manden.; 13. 白芷 Angelica dahurica Benth. et Hook.; 14. 狭叶当归 Angelica anomala Ave-Lall.; 15. 刺果芹 Turgenia latifolia (Linn.) Hoffm. Ⅰ. 美味芹族分支Clade of Trib. Smyrnieae; Ⅱ. 前胡族分支Clade of Trib. Peucedaneae. 分支上的数字为自展支持率 Numbers on the branches are the bootstrap values.

1. 川明参 Chuanminshen violaceum Sheh et Shan； 2. 明党参 Changium smyrnioides H. Wolff; 3. 舟瓣芹 Sinolimprichtia alpine H. Wolff; 4. 华中前胡 Peucedanum medicum Dunn; 5. 泰山前胡 Peucedanum wawrae (H. Wolff) Su; 6. 宝兴棱子芹 Pleurospermum davidii Franch.; 7. 丽江棱子芹 Pleurospermum foetens Franch.; 8. 鸡冠棱子芹 Pleurospermum cristatum de Boiss.; 9. 瘤果芹 Trachydium roylei Lindl.; 10. 宽叶羌活 Notopterygium franchetii C.T. Ting ex H.T. Chang; 11. 草地阿魏 Ferula kingdon-wardii H. Wolff; 12. 密毛大瓣芹 Semenovia pimpinelloides (Nevski) Manden.; 13. 白芷 Angelica dahurica Benth. et Hook.; 14. 狭叶当归 Angelica anomala Ave-Lall.; 15. 刺果芹 Turgenia latifolia (Linn.) Hoffm. Ⅰ. 美味芹族分支Clade of Trib. Smyrnieae; Ⅱ. 前胡族分支Clade of Trib. Peucedaneae. 分支上的数字为自展支持率 Numbers on the branches are the bootstrap values.

前胡族分支也可分为数个小支。泰山前胡和华中前胡始终聚为1个小支，当归属的狭叶当归和白芷也始终聚为1个小支；但密毛大瓣芹的位置变化较大，在ML系统树中位于前胡属和当归属2个小支的外部，而在MP和BI系统树中均与当归属的2个种类聚为1个小支；草地阿魏位置比较特殊，在MP系统树中聚在前胡族分支中，而在ML和BI系统树中则从前胡族分支中划出并独立于系统树基部，因而，阿魏属的系统关系也有待进一步探讨。

3 讨论和结论

3.1 psbA-trnH 片段在伞形科属间分类中的应用

从MP、ML及BI系统树可见：基于psbA-trnH片段序列分析建立族内属间的系统树，3种方法都具有比较理想的效果，说明psbA-trnH片段适用于川明参属与前胡族和美味芹族种类的亲缘关系分析。psbA-trnH 片段已被广泛用作被子植物物种鉴别的条形码，但目前该片段应用面临的最大困难是非同属物种间的序列比对，主要是插入/缺失位点过多所致[19]。本研究中，不同属种类的psbA-trnH片段序列的插入和缺失位点也较多，因此序列比对和人工校正相对比较繁琐；但该片段序列提供的变异位点也较多，可为族内属间的系统发育重建研究提供较丰富的信息。本项目组对供试种类也进行了基于ITS序列分析的分子系统学研究(另文发表)，得到的结果与其他研究者[5-6]的研究结果基本相同。因此，在伞形科属间系统关系研究中也可使用psbA-trnH片段；而在实际研究过程中也可1个或多个条形码片段组合使用。

3.2 川明参属分类地位的探讨

川明参在独立成属之前曾作为药材“明党参”使用。由于其分生果具有果体背腹压扁和侧棱稍宽等特征，1980年佘孟兰和单人骅将其从美味芹族明党参属中分出，独立为新属并归入前胡族[4]。从经典分类上看，这种分类处理有其合理性，因为果实强烈背腹压扁和侧棱发达是前胡族种类的特征之一。

从基于psbA-trnH片段构建的3类系统发育树可以看出：川明参总是与供试的美味芹族种类聚为一大支，而供试的前胡族种类则聚为另一大支。并且川明参与供试前胡族种类间的相对遗传距离较大(基本均大于1)，而与供试的美味芹族种类的相对遗传距离较小(小于0.2)。说明川明参与前胡族关系较远，与美味芹族的关系较近。以上结果均支持将川明参从前胡族调整到美味芹族的分类处理。

此外，近年来的相关研究结果也与传统的经典分类观点不同。惠红等[20]通过伞形科前胡族的血清系统学研究，认为川明参属与前胡族其他属的亲缘关系较远；邱英雄等[5]和陶晓瑜等[6]基于ISSR标记分析及ITS片段分析结果，提出将川明参置于美味芹族的分类观点；Zhou等[21]对包括明党参和川明参在内的10个中国伞形科特有种进行了分子系统进化研究，确定明党参属和川明参属共同位于同一分支中。由此可见，目前将川明参属置于前胡族中的分类处理不甚合理，建议将川明参属重新归入美味芹族。

3.3 川明参与明党参亲缘关系的分析

上述的MP、ML和BI系统树均显示川明参与明党参聚在一起，说明二者的亲缘关系非常近。从相对遗传距离来看，川明参与明党参间的相对遗传距离较小，仅为0.02，等同于伞形科某些属内种间的相对遗传距离，如供试棱子芹属的3个种类间的相对遗传距离也为0.02；但有些属间种类的相对遗传距离也较小，如密毛大瓣芹和2个当归属种类间的相对遗传距离也仅为0.02。说明川明参与明党参的亲缘关系极近，二者互为姐妹类群，但要判断川明参与明党参分属于不同属还是同一个属则需依据其他学科证据的验证。

川明参和明党参的外部形态特征和果实解剖特征有许多相似之处[22-24]：从外部形态看，二者的植株和果实发育季节和过程均比较相近；成熟果实表面皱缩，可看到突起的油管。从果实发育过程的解剖结构看，二者在幼果期都存在一段有角的五边形时期，可称之为果实发育的“五边态”，并且二者的胚乳发育趋势以及油管和维管束的分布方式和演化趋势相同。这也佐证了川明参和明党参具有较近的亲缘关系。

果实形态特征是伞形科植物的重要分类依据，而川明参和明党参的果实形态和解剖结构也存在一些差别。从横切面形状上看，川明参的成熟分生果横切面为背腹极度压扁的梭形，而明党参的则为肾状圆形；从油管数目上看，川明参果实棱槽处仅有1～2个油管，而明党参果实棱槽处有3～4个油管；从胚乳形状上看，明党参成熟果实的胚乳形状为“C”形，而川明参的则为新月形[22-24]。所以，依据果实压扁类型和果棱突起程度划分，川明参和明党参应分别位于果实背腹压扁且侧棱发达和果实不甚压扁且无果棱的2个类群中，也就是说应处理为2个独立属。

综合分子系统学与形态学的研究证据，作者认为川明参属应重新置于美味芹族中；而川明参属与明党参属应处理为2个独立属，但因二者亲缘关系较近，可并列为姐妹类群。

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