喜盐鸢尾Na+/H+逆转运蛋白基因IhNHX1的克隆及序列分析

赵沿海， 原海燕， 顾春笋， 黄苏珍

〔江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏省植物迁地保护重点实验室， 江苏 南京 210014〕

在盐胁迫环境中，Na+是危害植物生长发育甚至存活的主要胁迫离子，高浓度Na+可严重干扰植物对矿质元素的吸收并影响气孔的开关及一些依赖K+活化胞质酶的活性[1-2]。Na+/H+逆转运蛋白(NHX，Na+/H+antiporter)是位于细胞质膜和液泡膜上的一类跨膜载体蛋白，它可以利用液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPase提供驱动力建立跨膜质子梯度，将Na+和K+离子排出细胞质，减少Na+对细胞的毒害作用，从而提高植物的抗盐能力[3-4]。1976年，Murer等[5]在老鼠肾细胞中首次发现NHX蛋白；同年，Ratner等[6]在大麦(HordeumvulgareLinn.)质膜上发现该蛋白质；1985年，Blumwald等[7]在甜菜(BetavulgarisLinn.)根部的液泡膜上也发现该蛋白质。NHX1蛋白在植物体中含量丰富且分布广泛，目前已发现的NHX基因共有6种，表现出不同的时空表达模式；根据分布位置的不同及序列的相似性，可以将NHX基因分为2组[8-10]，一组为NHX1至NHX4，均分布在液泡膜上；另一组为NHX5和NHX6，主要分布在高尔基体及反面高尔基网上，在内涵体物质运输到液泡及调节内涵体pH值上发挥作用。

NHX蛋白属于结构性蛋白质，在无盐条件下活性较低；经过盐处理后，NHX蛋白的合成及活性均增加，表明该蛋白质与植物耐盐性密切相关[11]。目前，许多研究均证实NHX蛋白在植物耐盐方面起重要作用。例如：在NHX基因突变的酵母中表达拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕NHX基因后可以使酵母由盐敏感型转变为盐耐受型[12]；在水稻(OryzasativaLinn.)体内过量表达其自身的NHX基因能够提高其耐盐性[13]； Li等[14]的研究结果表明：转marker-freeAtNHX1基因的玉米(ZeamaysLinn.)的抗旱性及产量都有一定程度的提高；Wu等[15]认为：在霸王〔Zygophyllumxanthoxylum(Bunge) Maxim.〕耐盐胁迫和干旱胁迫中ZxNHX基因均有重要作用；Apse等[16]在拟南芥中过量表达AtNHX1基因，可显著提高拟南芥的耐盐性；Zhang等[17]将AtNHX1基因转入番茄(LycopersiconesculentumMill.)中并过量表达也可显著提高其耐盐性。

喜盐鸢尾(IrishalophilaPall.)为多年生宿根性草本植物，主要分布于新疆、甘肃和内蒙古[18]。喜盐鸢尾具有很强的耐寒性和耐旱性，观赏价值很高；其根、花和种子均可入药，具有清热解毒、利尿和止血等功效[19]。此外，喜盐鸢尾还是一种典型的盐生植物，在含308 mmol·L-1NaCl的培养液中仍然能够生长良好[20]，对植物耐盐性的研究具有重要的学术价值。

为明确喜盐鸢尾耐盐的分子机制，作者采用同源克隆和RACE法克隆获得喜盐鸢尾IhNHX1基因的全长序列，并对该基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行分析；对该基因编码的氨基酸序列与另外11种植物NHX1基因编码的氨基酸序列进行同源性比较和系统树分析，并分析了IhNHX1基因编码的蛋白质的二级结构和跨膜结构域，以期为喜盐鸢尾耐盐基因的挖掘与利用研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

实验用喜盐鸢尾种子为作者所在实验室保存。将喜盐鸢尾幼苗用1/2 Hoagland营养液水培15 d后，用含308 mmol·L-1NaCl的1/2 Hoagland 营养液水培1 d，采集新鲜叶片用于总RNA提取。

实验用M-MLV逆转录酶、rTaqDNA聚合酶、TdT末端加尾酶、T4-DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、pMD19-T载体、MiMiBEST DNA纯化试剂盒和Marker 2000均为宝生物工程(大连)有限公司产品；抗生素及其他相关试剂购自上海浩嘉生物工程公司；RNA提取试剂Trizol plus为南京天为生物科技有限公司产品；转化使用的菌株为大肠杆菌DH5α。

引物合成均由上海捷瑞生物工程有限公司完成；测序则由南京思普金生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 根据Trizol plus试剂说明书上的方法，用喜盐鸢尾鲜叶提取总RNA，并使用M-MLV逆转录酶合成DNA第1条链，即cDNA。

1.2.2 基因中间序列的克隆 根据GenBank中已登录的NHX1同源基因的核苷酸序列和氨基酸序列，利用Clustal W软件进行序列同源性在线比对，并分析它们的保守区域；利用CODEHOP软件、根据保守区序列在线设计兼并引物。引物NM1的序列为5′-CA TCTTCAACGCCGGCTTYCARGTNAA-3′；引物NM2的序列为5′-TCGGTCACGTTGTGCCANGTRTA-3′。其中，R=A/G、Y=C/T、N=A/C/G/T。

PCR反应体系总体积为25 μL，包括模板250 ng、10×PCR buffer (含Mg2+) 2.5 μL、dNTPs混合液(各2.5 mmol·L-1) 2 μL、正反向引物各1μL、rTaqDNA聚合酶0.15 μL，用灭菌双蒸水补足体积至25 μL。PCR扩增程序如下： 94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性 40 s、50 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s，共32个循环；最后于72 ℃延伸5 min。

将上述PCR扩增产物进行电泳凝胶回收，然后连接到pMD19-T载体上，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；将经过转化的感受态细胞涂布到含有50 μL·mL-1氨苄青霉素(ampicillin)的LB固体培养基上，过夜培养；分别挑取单菌落，接种至含有相同浓度氨苄青霉素的1 mL LB液态培养基中，振荡培养3 h后，对培养菌液的DNA进行PCR鉴定；将含有目的条带(即IhNHX1基因中间序列)的样品送测序公司进行测序。

1.2.3 基因3′端序列的克隆 采用3′RACE方法[21]克隆NHX1基因的3′端序列，利用Oligo 7软件、根据测序获得的IhNHX1基因中间序列设计3′端通用PCR引物和特异PCR引物。通用引物Olig(dT) primer的序列为5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTT TTTTT-3′，通用引物dT-AP的序列为5′-GACTCG AGTCGACATCGA-3′；特异引物N31的序列为5′- CATTTGCTGGATTGCTTAGTGC-3′，特异引物N32的序列为5′-AGGCATTCTACTGATCGTGAAG-3′。

使用通用引物Olig(dT) primer逆转录合成cDNA，并以cDNA为模板、用特异引物N31和通用引物dT-AP进行第1轮巢式PCR；再以第1轮巢式PCR扩增产物稀释100倍后的溶液为模板、用特异引物N32和通用引物dT-AP进行第2轮巢式PCR。巢式PCR的扩增程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s、50 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s，共32个循环；最后于72 ℃延伸7 min。巢式PCR产物经转化、克隆后，测序得到IhNHX1基因的3′端序列。PCR反应体系和转化、克隆等方法同上。

1.2.4 基因5′端序列的克隆 采用5′RACE方法[22]克隆NHX1基因的5′端序列，利用Oligo 7软件、根据测序获得的IhNHX1基因中间序列设计5′端正向PCR引物和反向特异PCR引物。正向引物5AP的序列为5′-GATGCGACTGCTCACTGACTGACTCTGACCGCATC GGGGGGGGGGH-3′， 正向引物5NP1的序列为5′-GATGCGACTGCTCACTGACTG-3′，正向引物5NP2的序列为5′-TGACTGACTCTGACCGCATC-3′；反向特异引物N51的序列为5′-CAAATGCTCCCAAGAAGGTG-3′，反向特异引物N52的序列为5′-ATCGAAGTTCT GTATTGCGTT-3′，反向特异引物N53的序列为5′-GCACCAAGAGAAATTATGACGAA-3′。

用反向特异引物N51逆转录合成cDNA；经MiMiBEST DNA纯化试剂盒纯化后，用TdT末端加尾酶为cDNA加上Poly(C)尾；以加尾后的cDNA为模板、用正向引物5AP进行PCR扩增，合成互补并加接头的双链DNA。PCR扩增程序如下：94 ℃预变性60 s；94 ℃变性20 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸70 s，共5个循环；最后于72 ℃延伸5 min。

以加接头的双链DNA为模板、用正向引物5NP1和反向特异引物N52进行第1轮巢式PCR；再以第1轮巢式PCR扩增产物稀释100倍后的溶液为模板、用正向引物5NP2和反向特异引物N53进行第2轮巢式PCR。巢式PCR扩增程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃预变性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸30 s，共32个循环；最后于72 ℃延伸5 min。巢式PCR产物经转化、克隆后，测序得到IhNHX1基因的5′端序列。PCR反应体系和转化、克隆等方法同上。

1.3 序列及蛋白质二级结构分析

采用DNAMAN软件对克隆得到的5′端、3′端和中间序列进行首尾拼接，得到IhNHX1基因的全序列；使用Oligo 7软件分析该基因编码的氨基酸序列。从GenBank数据库中选取与IhNHX1基因编码的氨基酸序列BLAST相似度大于80%的11种植物的同源氨基酸序列，通过Clustal W软件分析NHX1基因编码的氨基酸序列的保守性，并基于此基因编码的氨基酸序列、利用MEGA 6软件中的泊松分布模式构建12种植物的系统树。采用SOPMA软件在线分析IhNHX1基因编码的蛋白质的二级结构，并通过TMHMM 2.0软件在线分析该蛋白质的跨膜结构域。

2 结果和分析

2.1 IhNHX1基因的PCR扩增结果

根据设计的引物分别对喜盐鸢尾IhNHX1基因的中间序列、5′端序列和3′端序列进行PCR扩增，结果见图1。扩增得到的IhNHX1基因中间序列的片段长度约为600 bp，5′端序列的片段长度约为500 bp， 3′端序列的片段长度约为1 100 bp。

2.2 IhNHX1基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列分析

采用DNAMAN软件将克隆获得的喜盐鸢尾IhNHX1基因的5′端序列、中间序列及3′端序列进行首尾拼接后得到1条全长1 946 bp 的cDNA序列。通过Oligo 7软件分析可知： 该基因包含1个长度为1 611 bp的开放阅读框(ORF)，其编码的蛋白质共包含537个氨基酸。该基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列详见图2。

2.3 IhNHX1基因及其他植物NHX基因编码的氨基酸序列比较及同源性分析

氨基酸序列比较结果(表3)表明：喜盐鸢尾IhNHX1基因编码的氨基酸序列与平滑獐毛〔Aeluropuslagopoides(Linn.) Trin. ex Thwaites〕、双稃草〔Diplachnefusca(Linn.) Kunth〕、结缕草(ZoysiajaponicaSteud.)、芦苇〔Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.〕、玉米、毛竹〔Phyllostachysedulis(Carr.) J. Houz.〕、可可(TheobromacacaoLinn.)、小米〔Setariaitalica(Linn.) P. Beauv.〕、葡萄(VitisviniferaLinn.)、甜橙〔Citrussinensis(Linn.) Osbeck〕和金钱橘(CitrusclementinaHort.)11种植物NHX1基因编码的氨基酸序列的一致性高达96.2%(图中彩色区域所示)，其中完全一致的序列占61.7%(图中黄色区域所示)，表明该氨基酸序列保守性较高。

M： 分子量标记Marker 2000； 1： 中间序列Middle sequence； 2： 5′端序列 5′ end sequence； 3： 3′端序列 3′ end sequence.

图2 喜盐鸢尾IhNHX1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列

A: 氨氯吡嗪结合位点 Ammonia chloride pyrazine binding site; B: CaM结合结构域 CaM binding domain.

此外，喜盐鸢尾IhNHX1基因编码的氨基酸序列上有2个保守结构域即图3中的黑框A和黑框B，这2个结构域均为NHX1蛋白上极为保守的结构域[23]。其中，黑框A为NHX1蛋白上的氨氯吡嗪结合位点，该位点是NHX1蛋白的标志性结合位点；黑框B为NHX1蛋白上的CaM结合结构域，该结构域是NHX1蛋白的重要调节区域。

基于喜盐鸢尾IhNHX1基因编码的氨基酸序列与上述11种植物NHX1蛋白的氨基酸序列、利用MEGA 6软件中的泊松分布模式构建系统树，结果见图4。整体上看，同科植物间的亲缘关系最近，如禾本科(Poaceae)植物平滑獐毛、双稃草、结缕草、芦苇、玉米和小米之间的分支长都在0.1以内，而芸香科(Rutaceae)植物甜橙与金钱橘之间的分支长为0。在此系统树中，喜盐鸢尾与其他植物的分支长均大于1.2，表明从NHX1蛋白的氨基酸序列来看，喜盐鸢尾与其他11种植物间的亲缘关系均较远。

2.4 IhNHX1基因编码的蛋白质二级结构分析

采用SOPMA软件在线分析喜盐鸢尾IhNHX1基因编码的蛋白质二级结构，结果见图5；通过TMHMM 2.0软件在线分析该蛋白质的跨膜结构域，结果见图6。由图5可见：在喜盐鸢尾IhNHX1蛋白的二级结构中，α螺旋(αhelix)占48.60%，不规则卷曲(random coil)占32.03%，延伸链(extended strand)占14.71%，氢键转角(hydrogen bonding turn)占4.66%。由图6可见：喜盐鸢尾IhNHX1蛋白共包含10个跨膜结构域。

IH: 喜盐鸢尾Iris halophila Pall.; CS: 甜橙Citrus sinensis (Linn.) Osbeck; CC: 金钱橘Citrus clementina Hort.; TC: 可可Theobroma cacao Linn.; VV: 葡萄Vitis vinifera Linn.; PE: 毛竹Phyllostachys edulis (Carr.) J. Houz.; AL: 平滑獐毛Aeluropus lagopoides (Linn.) Trin. ex Thwaites; DF: 双稃草Diplachne fusca (Linn.) Kunth; ZJ: 结缕草Zoysia japonica Steud.; PA: 芦苇Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud.; SI: 小米Setaria italica (Linn.) P. Beauv.; ZM: 玉米Zea mays Linn.

h: α螺旋 α helix； e： 延伸链 Extended strand； c： 不规则卷曲 Random coil； t: 氢键转角 Hydrogen bonding turn.

图6 喜盐鸢尾IhNHX1基因编码的蛋白质的跨膜结构域

3 讨论和结论

通过同源克隆和RACE方法克隆获得喜盐鸢尾IhNHX1基因的全序列，序列总长度为1 946 bp，包含1个长度为1 611 bp的开放阅读框(ORF)，共编码537个氨基酸。喜盐鸢尾IhNHX1基因编码的氨基酸序列与其他11种植物NHX1基因编码的氨基酸序列的保守性均较高，存在很多完全一致的序列，这些保守区应是IhNHX1基因的功能区；而从系统树上却可看出喜盐鸢尾与其他11种植物的亲缘关系均较远。上述研究结果说明，在进化过程中，植物蛋白质功能区域序列的保守性能够有效保证该蛋白质的活性。比较分析结果表明：喜盐鸢尾IhNHX1基因编码的氨基酸序列与其他11种植物NHX1基因编码的氨基酸序列在非相同区域的差异较大，这些差异是否与喜盐鸢尾具有较高的耐盐性有关?尚有待对IhNHX1基因进行进一步的研究确认。

对IhNHX1基因编码的蛋白质二级结构和跨膜结构域的分析结果表明：该蛋白质的α螺旋所占比例最高，达48.60%；不规则卷曲占32.03%，并且该蛋白质由10个跨膜结构域组成。Yamaguchi等[24]通过蛋白酶保护实验证明：拟南芥的液泡膜NHX蛋白由12个跨膜结构域组成，并提出1个拓扑结构模型。可见，喜盐鸢尾的IhNHX1蛋白结构模型与Yamaguchi等提出的拓扑结构模型存在一定差异。

通常，在使用经典的5′RACE方法克隆基因的5′端时，很容易产生很多非特异性条带，难以辨别目的条带，对此，有研究者已提出很多改进的5′RACE方法[25]。在本研究中，作者在经典5′RACE方法基础上，结合一些通用的5′端引物对5′端正向引物进行优化设计，提高了PCR扩增的特异性。具体步骤如下：首先，在5AP引物的特异序列部分设计能够自身环化或形成双链的序列，以便露出Poly(G)尾与模板链上的Poly(C)结合；其次，在5AP引物末端加入兼并碱基H(A/T/C)，使之可以与除C外的其他碱基配对，帮助该引物锚定在模板Poly(C)尾结束的第1个碱基上；再次，设计了2条巢式PCR引物，即5NP1和5NP2，通过巢式PCR扩增减少非特异条带。此外，5AP引物中的Poly(G)部分连续超过5个G的序列较难合成，可以参照AAP引物序列“GGCCACGCGT CGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG”的Poly(G)部分进行合成，即在引物Poly(G)中增加稀有碱基I，即GGGGIIGGGGIIGGGG。以上引物优化设计对基因5′端正向引物的设计有一定的借鉴作用，但由于不同基因的5′端结构存在一定差异，因此，不同基因的5′端正向引物还需要通过不同的优化设计才能取得较好的扩增效果。

参考文献:

[1] 马玉花. 植物耐盐分子机理研究进展[J]. 湖北农业科学, 2013, 52(2): 255-257, 261.

[2] 李彦强, 方升佐, 姚瑞玲, 等. NaCl胁迫对不同种源青钱柳幼苗离子分配、吸收与运输的影响[J]. 植物资源与环境学报, 2007, 16(4): 29-33.

[3] 赵祥强, 汤 薇, 张 燕, 等. 互花米草中NHX基因片段的克隆与序列分析[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(36): 17878-17882, 17907.

[4] QIU Q S. Plant and yeast NHX antiporters： roles in membrane trafficking[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2012, 54(2): 66-72.

[5] MURER H, HOPFER U, KINNE R. Sodium/proton antiport in brush-border-membrane vesicles isolated from rat small intestine and kidney[J]. The Biochemical Journal, 1976, 154(3): 597-604.

[6] RATNER A, JACOBY B. Effect of K+, its counter anion, and pH on sodium efflux from barley root tips[J]. Journal of Experimental Botany, 1976, 27(5): 843-852.

[7] BLUMWALD E, POOLE R J. Na+/H+antiport in isolated tonoplast vesicles from storage tissue ofBetavulgaris[J]. Plant Physiology, 1985, 78(1): 163-167.

[8] BASSIL E, TAJIMA H, LIANG Y C, et al. TheArabidopsisNa+/H+antiporters NHX1 and NHX2 control vacuolar pH and K+homeostasis to regulate growth, flower development, and reproduction [J]. The Plant Cell, 2011, 23(9): 3482-3497.

[10] BASSIL E, OHTO M, ESUMI T, et al. TheArabidopsisintra-cellular Na+/H+antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and development[J]. The Plant Cell, 2011, 23(1): 224-239.

[11] 杜利霞, 董宽虎, 朱慧森. 植物Na+/H+逆向转运蛋白研究进展[J]. 草原与草坪, 2012, 32(2): 82-86.

[12] GXIOLA R A, RAO R, SHERMAN A, et al. TheArabidopsisthalianaproton transporters, AtNhx1 and Avp1, can function in cation detoxification in yeast[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(4): 1480-1485.

[13] FUKUDA A, NAKAMURA A, TAGIRI A, et al. Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+antiporter from rice[J]. Plant Cell Physiology, 2004, 45(2): 146-159.

[14] LI B, LI N, DUAN X G, et al. Generation of marker-free transgenic maize with improved salt tolerance using the FLP/FRT recombination system[J]. Journal of Biotechnology, 2010, 145(2): 206-213.

[15] WU G Q, XI J J, WANG Q, et al. TheZxNHXgene encoding tonoplast Na+/H+antiporter from the xerophyteZygophyllumxanthoxylumplays important roles in response to salt and drought [J]. Journal of Plant Physiology, 2011, 168(8): 758-767.

[16] APSE M P, AHARON G S, SNEDDEN W A, et al. Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiport inArabidopsis[J]. Science, 1999, 285(5431): 1256-1258.

[17] ZHANG H X, HODSON J N, WILLIAMS J P, et al. Engineering salt-tolerantBrassicaplants: characterization of yield and seed oil quality in transgenic plants with increased vacuolar sodium accumulation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(22): 12832-12836.

[18] 杨宏伟, 周考文, 于春洋. 蓝花喜盐鸢尾和喜盐鸢尾的化学成分比较分析[J]. 光谱实验室, 2011, 28(5): 2723-2727.

[19] 韩玉林. 铅与盐胁迫对喜盐鸢尾生长及生理抗性的影响[J]. 西北植物学报, 2008, 28(8): 1649-1653.

[20] 佟海英, 马晶晶, 原海燕, 等. NaCl和Na2CO3胁迫对5种鸢尾属植物生长的影响[J]. 江苏农业科学, 2012, 40(11): 144-148.

[21] 唐克轩, 开国银, 张 磊, 等. RACE的研究及其在植物基因克隆上的应用[J]. 复旦学报: 自然科学版, 2002, 41(6): 704-709.

[22] 邓雪柯， 殷建华， 曹 毅. 3种5′RACE技术的比较与优化[J]. 成都医学院学报, 2007， 2(1)： 20-25.

[23] 李 翠. 荞麦Na+/H+逆向转运蛋白基因FtNHX的克隆、功能验证及表达分析[D]. 上海: 华东师范大学生命科学学院, 2010.

[24] YAMAGUCHI T, APSE M P, SHI H Z, et al. Topological analysis of a plant vacuolar Na+/H+antiporter reveals a luminal C terminus that regulates antiporter cation selectivity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(21): 12510-12515.

[25] 徐 烨, 刘雅婷, 代文琼, 等. 几种主要的RACE技术及应用[J]. 中国农业科技导报, 2012, 14(2): 81-87.