多功能M13KE噬菌体展示系统的建立

方月琴郭娟宁陆豪杰朱国强

（1. 江苏健雄职业技术学院，苏州 215411；2. 扬州大学兽医学院，扬州 225009；3.新乡医学院，新乡 453003）

多功能M13KE噬菌体展示系统的建立

方月琴1郭娟宁2陆豪杰1朱国强3

（1. 江苏健雄职业技术学院，苏州 215411；2. 扬州大学兽医学院，扬州 225009；3.新乡医学院，新乡 453003）

以M13KE噬菌体为起始载体，建立一种无需辅助噬菌体的较长片段多肽库展示系统，以解决当前噬菌体展示仅能筛选短肽库现象，并扩大靶向高通量筛选范畴。根据M13KE次要外壳蛋白（Minor coat protein of wild-type M13KE，wt-pIII）基因III（wt-gene III）结构与功能关系，设计并扩增出能发挥其基因功能的截短基因III（Truncated gene III，tgIII）；通过拼接-重叠-延伸PCR（Splice-overlapping-extension polymerase chain reaction，SOEing-PCR）获得含启动子、信号肽和结构基因的融合基因片段，将其插入至M13KE载体的合适部位，进行蛋白质诱导表达，SDS-PAGE和Western blot分析。同时在wt-gIII和tgIII部位分别插入HA和c-Myc多肽标签，再次进行表达和检测。结果显示，tgIII被插入到M13KE的非必需部位，利用抗蛋白III（anti-M13 pIII）抗体进行Western blot检测发现，wt-gIII和tgIII均能表达pIII（protein III，pIII）；anti-HA和c-Myc抗体都能检测到2个标签蛋白和pIII蛋白质的表达。获得一种多功能M13KE载体，具有既能表达短片段多肽库，也能表达较长片段多肽库的潜能，而且无需辅助噬菌体，可用于更大范围的高通量靶向筛选。

靶向高通量筛选 噬菌体展示系统 M13KE 长片段多肽库

噬菌体展示系统是以丝状噬菌体为载体，将外源蛋白或多肽的基因表达产物与其外壳蛋白融合，使得外源蛋白或多肽在其表面得以展示，进而通过筛选获得表达有特异性蛋白质或多肽的噬菌体，再进行富集［1］。其优点是直接将基因型与表型联系到一起，再利用其与配体的特异性亲和力，将目的蛋白质或多肽筛选出来。所用丝状噬菌体主要有M13KE、fd和fe等，它们通过gIII侵染携带F’的大肠杆菌，而外源基因大多插入到gIII中，以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面［2］。

但是如果外源基因过长会造成噬菌体感染能力的失去，因而现有展示系统只能够表达短片段多肽，很多时候不能够满足蛋白质靶向筛选的要求［3］。或者是在辅助噬菌体存在的情况下完成长肽筛选，但是增加了操作过程的繁琐性［4-8］。因此，本研究以M-13KE为载体［9］进行改造，目的是建立针对较长片段多肽或蛋白质库筛选、又不影响其复制感染能力、且无需辅助噬菌体存在的高通量噬菌体展示系统。

1 材料与方法

1.1 PCR获得tgIII

通过两步PCR法获得M13KE载体（New England Biolabs，USA）wt-gIII的启动子与信号肽的基因序列。两步PCR包括了拼接PCR（Dual-assembly PCR，DA-PCR）和延伸PCR（Over-extension PCR，OE-PCR）［10］。所需引物和步骤如图1所示。接着以M13KE双链DNA为模板PCR扩增得到gIII的C-端区域DNA，引物为M13F（5'-3'）：ACT AGT GGT GGC TCT GGT TCC GGT GAT TTT G；M13R（5'-3'）：GCC GGA ATT CGC GCA CTG CTT ATT AAG ACT CCT TAT TAC。最后利用SOEing-PCR法将上列3种DNA序列进行拼接，得到tgIII全长。

PCR体系为37.5 μL，在1×pfu缓冲液中加入200 μmol/L dNTP，7.5 U pfu DNA聚合酶（Fermentas，USA），合适的DNA引物和DNA模板。PCR反应条件为94℃ 5 min，94℃ 30 s，53℃ 30 s和72℃ 45 s共25个循环，之后72℃延伸7 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。

1.2 基因克隆

tgIII首先插入至pJETTMPCR克隆载体（Fermentas，USA），经克隆PCR、酶切、测序鉴定序列正确后，用BstI酶（New England Biolabs，USA）将tgIII片段切下，胶纯化（Qiagen，Germany）；同时将M13KE用该酶切后，胶纯化；再将两者进行连接克隆入M13KE，最终得到M13KE-tgIII载体。

1.3 标签蛋白HA和c-Myc的克隆

分别将HA序列插入tgIII，c-Myc序列插入wtgIII信号肽序列的3'端。首先根据氨基酸密码子优化原则设计一对反向互补引物，两端携带相应粘末端，接着将其进行94℃高温变性、55℃退火连接，形成具有相应酶切位点粘末端的互补双链，与酶切的M13KE载体连接。HA标签两端为SacII和SpeI酶切位点，引物序列为HA-F（5'-3'）：GGC CGA ATA CCC ATA CGA CGT TCC AGA CTA CGC TTC，HA-R（5'-3'）：GGC CGA AGC GTA GTC TGG AAC GTC GTA TGG GTA TTC。C-Myc两端为EagI酶切位点对应序列，引物序列为：Myc-F（5'-3'）：GGC CGA ACA GAA GCT GAT CTC TGA AGA AGA CCT GTC，Myc-R（5'-3'）：GGC CGA CAG GTC TTC TTC AGA GAT CAG CTT CTG TTC。最终获得的载体称为M13KE-HA-Myc。

1.4 M13KE噬菌体蛋白质SDS-PAGE分析

3 mL LB培养液（1 L ddH2O中10 g 蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，121℃灭菌25 min）中加入60 μL过夜培养的ER2738菌和2.5 μL噬菌体上清，37℃培养至指数生长阶段，转移至40 mL LB液中培养1 h，加入不同浓度IPTG溶液（Fermentas，USA）进行诱导。诱导结束，将培养液离心≥6 000 r/min，8 min。上清液转移至干净试管中，加入1/5体积比的PEG/NaCl 溶液，混匀，4℃沉淀至少5 h。12 000 r/min 4℃离心20 min，弃上清，沉淀溶于TBS（1L ddH2O中 6.06 g Tris，8.766 g NaCl，0.5%（V/V）Tween-20）。噬菌体蛋白质在12% SDS-PAGE上电泳分离，染色（Bio-Rad，USA）。

1.5 噬菌体蛋白质的Western印迹分析

噬菌体蛋白质SDS-PAGE分离之后，经小型Bio-Rad Trans-blot转印槽（Bio-Rad，USA），30V低温过夜或是60 V室温3 h，转移至纤维素膜（Millipore，Germany）。接着取出纤维素膜，在5%脱脂牛奶封闭液中封闭2-3 h，一抗（Anti-M13 pIII 1：200，New Engl-and Biolabs，USA；anti-c-Myc［11，12］，anti-HA［13］1∶1 000，Sigma-Aldrich，USA）4℃孵育过夜，TBST充分洗涤，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（1∶8 000，Sigma-Aldrich，USA）孵育2 h，TBST充分洗涤4次后利用HRP显色试剂盒（Bio-Rad，USA）进行蛋白质显色。

2 结果

2.1 tgIII的基因合成

tgIII由3部分组成，包括启动子、信号肽和C端gIII（图2），与wt-gIII相比，删去了不影响pIII功能的N端gIII序列。启动子和信号肽为210 bp，C端gIII为490 bp。首先通过DA-PCR和OE-PCR方法获得启动子-信号肽序列，之后将其与C-端gIII的PCR产物经SOEing-PCR进行拼接，获得tgIII全长约700 bp，两端携带BstI酶切位点（图3）。

2.2 M13KE-tgIII载体构建

tgIII首先插入pJET克隆载体，经酶切、测序明确序列正确后，BstI酶切，胶纯化得到tgIII片段。M13KE（图4-A）也经该酶酶切，胶纯化，与tgIII片段进行连接，转化，鉴定，最终得到M13KE-tgIII载体（图4-B）。

2.3 M13KE-tgIII载体的噬菌体蛋白

SDS-PAGE和Western印迹分析，M13KE-tgIII载体经IPTG诱导，分离出噬菌体蛋白质，在SDSPAGE电泳银染图（图5）能见到5.5 kD左右的主要衣壳蛋白pVIII，其他蛋白质在电泳图上不可见。

用anti-M13 pIII单克隆抗体进行Western blot检测，结果（图6）发现有2个不同分子量大小的pIII，wt-pIII约为70 kD，tpIII电泳所示分子量大小约35 kD，与文献报道一致［14］。

2.4 构建M13KE-HA-tgIII-Myc载体和标签蛋白表达分析

通过克隆技术分别将c-Myc和HA标签插入tgIII和wt-gIII的信号肽与成熟pIII之间。之后分别利用相应抗体进行检测。375 μmol/L IPTG 诱导6 h，分别检测到c-Myc标记融合蛋白wt-pIII（图7-A）和HA标记的tpIII（图7-B），表明载体M13-HA-Myc顺利表达2个不同分子量大小的pIII蛋白。

3 讨论

目前市场上流行的New England Biolabs公司的M13KE噬菌体展示系统，是在wt-gIII的信号肽与基因之间插入多肽库，但均为7 aa，9 aa的短肽库，往往不能满足长肽链的筛选［15，16］。本研究构建一种携带两个gIII的M13KE载体，其中wt-gIII保留其感染宿主细菌的能力，tgIII携带长片段多肽库，用于进行靶向筛选。

为减少插入大片段基因对M13KE噬菌体功能的影响，wt-gIII中C端区域被删去，保留启动子、信号肽和N端区域组成的tgIII，其转录得到的tpIII能够更有效地将其携带的蛋白质表达到噬菌体外壳，但是对噬菌体包装与分泌不造成影响［1］。由于tgIII删除了C端区域，失去了感染宿主菌及包装蛋白的能力，因此在携带有tgIII的噬菌体中，同时需存在wt-gIII以保持感染与成熟蛋白复制包装的能力［17］，或者通过增加辅助噬菌体以完成上述功能［18］。本研究即采用前者，即保留wt-gIII的感染能力。

经PCR、克隆步骤得到M13KE-tgIII后，用anti-pIII单克隆抗体对两个pIII进行蛋白质表达检测，能检测到2个不同分子量大小的pIII。之后在wt-gIII和tgIII的启动子与表达区域之间分别插入c-Myc和HA标签蛋白，以检测它们与pIII融合蛋白的表达。经anti-c-Myc和anti-HA 2种单克隆抗体检测，均在相应分子量大小的位置出现pIII蛋白质。这说明tgIII的成功克隆与tpIII的成功表达，并表明了tgIII的信号肽之后进行克隆长片段多肽库的潜能。这也是本课题下一步研究方向。

本试验构建的M13KE-tgIII载体既可在wt-gIII部位插入短片段多肽，用于短肽库的构建，也具有在tgIII上插入长片段多肽库的潜能，有望进行短肽库与长肽库之间的筛选，简化了多肽库筛选的操作，扩大了噬菌体展示高通量筛选的选择。

4 结论

以M13KE噬菌体为起始载体，通过SOEing-PCR法获得能发挥gIII基因功能的tgIII，并将tgIII插入至M13KE载体的合适部位，获得一种能表达长片段多肽的M13KE-tgIII载体，检测到tgIII基因表达。同时在wt-gIII和tgIII部位分别插入HA和c-Myc多肽标签，再次进行表达和检测，能检测到2个标签蛋白，最终得到M13KE-tgIII和M13-HA-gIII-Myc载体。

［1］ Barbas III CF, Burton DR, Scott JK, et al. Phage display, a laboratory manual［M］. Cold Spring Harbor, New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001：18-26.

［2］ Smith GP, Petrenko VA. Phage display［J］. Chemical Review, 1997, 97（2）：391-410.

［3］ Kay BK, Winter J, McCafferty J. Phage display of peptides and proteins：a laboratory manual［M］. San Diego：Academic Press, 1996：38-42.

［4］ Sidhu SS, Feld BK, Weiss GA. M13 bacteriophage coat proteins engineered for improved phage display［M］. Methods Mol Biol, 2007, 352：205-219.

［5］ Henry TJ， Pratt D. The proteins of bacteriophage M13［J］. PNAS, 1969, 62（3）：800-807.

［6］ Young L, Dong QH. Two-step total gene synthesis method［J］. Nucleic Acids Research, 2004, 32（7）：e59.

［7］ Evan GI, Lewis GK, Ramsay G, et al. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-Myc proto-oncogene product［J］. Molecular and Cellular Biology, 1985, 5（12）：3610-3616.

［8］ Barbas CF. Phage Display：a laboratory manual［M］. Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

［9］ Wilson IA, Niman HL, Houghten RA, et al. The structure of an antigenic determinant in a protein［J］. Cell, 1984, 37（3）, 767-778.

［10］ van Wezenbeek PM, Hulsebos TJ, Schoenmakers JG. Nucleotide sequence of the filamentous bacteriophage M13 DNA genome：comparison with phage fd［J］. Gene, 1980, 11（1-2）：129-148.

［11］ 罗扬拓, 朱承睿, 武元, 等. 噬菌体展示技术发展［J］. 现代生物医学进展, 2011, 11（12）：2389-2390.

［12］ 孟繁梅, 张朝辉, 艾云灿. 噬菌体展示技术系统发展进展［J］.遗传, 2011, 30（10）：1113-1120.

［13］ Nanduri V, Sorokulova IB. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption［J］. Biosens Bioelectron, 2007, 22（6）：986-992.

［14］ Crameri R, Suter M. Display of biologically active proteins on the surface of filamentous phages：a cDNA cloning system for selection of functional gene products linked to the genetic information responsible for their production［J］. Gene, 1993, 137（1）：69-75.

［15］ Lowman HB, Bass SH, Simpson N, et al. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display［J］. Biochemistry, 1991, 30（45）：10832-10838.

［16］ Soltes G, Hust M, Bansal A, et al. On the influence of vector design on antibody phage display［J］. J Biotechnol, 2007, 127（4）：2626-2637.

［17］ Zwick MB, Bonnycastle LC, Noren KA, et al. The Maltose-binding protein as a scaffold for monovalent display of peptides derived from phage libraries［J］. Anal Biochem, 1998, 264（1）：87-97.

［18］ Paschke M. Phage display systems and their applications［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 70（1）：2-11.

（责任编辑 李楠）

Construction of a Multipurpose M13KE Phage Display System

Fang Yueqin1Guo Juanning2Lu Haojie1Zhu Guoqiang3
（1. Dept. of Biological and Chemical Engineering，Chien-Shiung Institute of Technology，Suzhou 215411；2. College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou 225009；3. Dept. of Medical School，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003）

It was to engineer a multipurpose M13KE phage display vector from M13KE wild-type phage for the longer peptide or protein display library without helper phage, as well as to expand the scope of targeting high-throughput screening. Based on the relationship of the structure and function of minor coat protein of wild-type M13KE, a truncated gene III encoding minor coat protein from M13KE phage was cloned and a fusion gene fragment containing alac/tacpromoter and the gene III signal peptide sequence was assembled using splice-overlappingextension polymerase chain reaction. SDS-PAGE and Western blot analysis with anti-M13 pIII monoclonal antibody was employed to detect the expression of the recombinant gene III. Two peptide tags, c-Myc and HA tag sequences were fused to the recombinant gene for expression and analysis, and the following screening steps. The recombinant gene III（tgIII）was inserted into the unessential part of M13KE and the corresponding protein III was detected with SDS-PAGE and Western blot with the anti-pIII antibody. The tgIII containing two tags expressed both c-Myc and HA peptides using methods of SDS-PAGE and Western blot with their specific monoclonal antibodies. We made the construction of a multipurpose M13KE phage display system. In the near future, we hope to apply this engineered phage display vector to carry longer peptide libraries for high-throughput screening without helper phage.

High-throughput screening Phage display M13KE Longer peptide library

2013-08-08

国家自然科学基金项目（31270171），江苏高校优势学科建设工程资助项目

方月琴，女，博士研究生，助理研究员，研究方向：生物医学；E-mail：yueqinfang@aliyun.com

朱国强，男，博士，教授，研究方向：病原微生物和免疫学；E-mail：yzgqzhu@yzu.edu.cn