Tgf2转座子多克隆位点的克隆与表达

陶然常玉梅梁利群唐然窦新杰，3王楠，3李明云

（1. 宁波大学海洋学院，宁波 315211；2. 淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室 农业部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；3. 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306）

Tgf2转座子多克隆位点的克隆与表达

陶然1，2常玉梅2梁利群2唐然2窦新杰2，3王楠2，3李明云1

（1. 宁波大学海洋学院，宁波 315211；2. 淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室 农业部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070；3. 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306）

以金鱼pTgf2-EF1α-EGFP转座子为基础，构建含有多克隆位点（Multiple cloning sites，MCS）序列以及外源目的基因肌醇-3-磷酸合成酶（Myo-inositol-3-phosphate synthase，MIPS）的重组表达载体并注射到斑马鱼1-2期受精卵，检测重组表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP和pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP在斑马鱼中绿色荧光蛋白基因（EGFP）的表达情况以及外源基因MIPS在斑马鱼体内的整合情况。荧光观察结果显示，两个重组载体均不影响EGFP的表达，只是表达强度存在一定差异，表明对Tgf2转座子的改造是有效的。转基因斑马鱼PCR检测结果显示，靶基因MIPS的编码区能够完整地整合到斑马鱼基因组中，整合效率达31.4%。重组表达载体的成功构建显示金鱼Tgf2转座子可以介导外源基因在斑马鱼中的表达，为以后Tgf2转座子在鱼类基因功能研究方面奠定了基础。

金鱼 Tgf2转座子 MCS序列 转基因斑马鱼

DNA转座子的实质是一段能改变宿主基因组插入位点的DNA序列［1，2］，通常存在于矮牵牛（Petunia hyhridaVilm）、飞燕草（Delphinium grandiflorumL.）、金鱼草（C.demersum）、甜豌豆（Lathyrus odoratusL.）等植物以及一些低等非脊椎动物中［3，4］。由于转座子存在种属特异性，一直以来转座子在脊椎动物中的应用仍是空白。直到1996年，日本学者Koga等［5］首次在白化变异青鳉（Oryzias latipes）中发现了具有自主转座活性的脊椎动物转座子——Tol2转座子。Tol2转座子与果蝇（Drosophila melanogaster）Hobo、金鱼草（Antirrhinum majus）Tam3和玉米（Zea maysL.）Ac等均属于hAT转座子家族［6］。

Tol2转座子作为高效的基因转移工具，在一些脊椎动物如斑马鱼（Danio rerio）、非洲爪蝉（Xenopus laevis）和鸡中的转座效率较高［7-9］，而在青鳉中的转座效率还是很低［10］。因此，对于在不同脊椎动物中都能高效表达的转座子还在不断探索发现中。

2010年，邹曙明［10］等在不同品系金鱼中发现了具有自主转座活性的脊椎动物转座子——Tgf2转座子，此转座子也属于hAT转座子家族，这是目前发现的第2个自主转座的脊椎动物转座子。Tgf2转座子全长4 720 bp，包含4个完整的开放性阅读框（ORFs）。其与Tol2转座子相似度高达97%，具有转座必须的末端倒位重复序列（Terminal inverted repeats，TIRs）、亚末端重复序列（Subterminal repeats，SRs）和中间倒位重复序列（Internal inverted repeats，IRs）［11，12］。研究证实，Tgf2转座子具有高效内源性转座活性［13］。金鱼Tgf2转座子的发现不仅对此类转座子的转座效率、各组成元件的功能研究具有指导性意义和较高价值，并且构建高效、通用的Tgf2转座系统更会促进鱼类转基因和基因捕获方面的发展［12，14］。

多克隆位点（Multiple cloning sites，MCS）是包含多个限制性内切酶酶切位点的长度为几十个碱基的DNA序列，也称为多位点接头，是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。然而，由于基因结构的复杂性和多样性，在将外源基因插入含有MCS的载体中时，MCS序列包含的酶切位点的种类有时难以满足特定研究需求，导致特定基因功能分析无法顺利进行，形成分子生物学研究领域的瓶颈。因此，迫切需要一种简单有效的MCS序列的人工设计与合成方法，以此满足不同科研工作的需求。MIPS催化底物葡萄糖-6-磷酸（G6P）转化成磷酸肌醇（IP），是肌醇合成的限速酶MIPS基因［15］。MIPS基因被认为是调节大脑肌醇水平的潜在药靶［16］，并且在保护植物免受外部逆境伤害过程中发挥重要作用，与逆境胁迫处理下的抗性有关，其表达受到干旱、盐胁迫和低温的诱导［17］。本研究根据Tgf2载体原始系统，人工设计并合成一段符合特定需求的MCS序列，将其克隆至Tgf2转座子系统验证其有效性，以此解决大多数外源目的基因编码序列无法插入到一些商业化载体中进行基因功能验证的不足。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鱼与载体来源 斑马鱼为AB品系；PMD-18T/MIPS质粒由本实验室自制pTgf2-EF-1α-EGFP质粒由上海海洋大学邹曙明老师惠赠。

1.1.2 培养基 LB培养基（酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、Nacl 10 g/L，pH7.0），固体培养基另加琼脂粉（Agar）15 g/L。

1.1.3 酶与试剂 限制性内切酶（ACSI、Xmal I）购自NEB，限制性内切酶（Hind III、SalI）、大肠杆菌DH5α、pMD18-T载体、Taq聚合酶、2000 DNA Marker、T4 DNA 连接酶、凝胶回收试剂盒均购自大连宝生物（TaKaRa）工程公司；质粒DNA提取试剂盒TIANGEN公司，其他试剂都是国产分析纯产品。引物合成及测序由北京英俊生物技术公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MCS序列设计与合成 利用Primer premier 5.0软件设计多克隆位点序列，从酶切位点表中选择表达载体Tgf2及目标靶基因中都不存在的11个酶切位点，分别为Hind III、StuI、BclI、BspE I、PmeI、AscI、SmaI/XmaI、PacI、HaeIII、ScaI、SalI；将设计好的MCS序列的两两酶切位点之间以ATAT碱基结构串联，在串联后的碱基序列两端各添加与表达载体克隆区相同的两个酶切位点Hind III和SalI；再将上述序列两末端随机添加GGAACC碱基（图1），然后送至测序公司合成，由此完成了MCS序列的人工设计与合成。根据MCS两端序列，设计正向引物P1（5'-CCCAAGCTTATGCATGCATATTG-3'）与反向引物P2（5'-GGTTCCACGCGTCGACATATAGTAC-3'），用于长度为121 bp MCS寡核苷酸链的PCR扩增。

1.2.2 PMD-18T/MCS质粒的构建 将合成的MCS寡核苷酸链利用引物P1、P2进行PCR扩增，反应体系（25 μL）：MCS模板1 μL，引物P1、P2各1 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR扩增条件为：95℃ 5 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环，72℃ 7 min；反应结束后，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收MCS条带，回收条带与pMD18-T载体连接，16℃水浴连接30 min，然后转化至大肠杆菌DH5α，37℃倒置培养过夜。选择经蓝白斑筛选后的阳性克隆进行菌斑PCR反应，反应体系（25 μL）Master Mix 12.5 μL，通用引物AVM和M13-47各1 μL，H2O 10.5 μL，PCR扩增条件同上；反应结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性克隆摇菌提取质粒，然后送测序公司进行测序。

1.2.3 表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP（多克隆位点表达载体）的构建 将经测序验证的pMD-18T/MCS质粒与pTgf2-EF1α-EGFP质粒利用限制性内切酶Hind III和SalI分别进行双酶切，反应体系（20 μL）：Hind III和SalI各 1 μL，10×K buffer 3 μL，pMD18-MCS质粒或Tgf2 质粒 3 μL，H2O 12 μL，37℃酶切3 h，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收。将回收的MCS片段与Tgf2质粒大片段进行连接反应，反应体系（10 μL）：MCS回收产物7 μL，Tgf2质粒酶切回收产物1 μL，T4连接酶1 μL，T4连接buffer 1 μL，16℃水浴连接过夜，次日转化，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆进行菌斑PCR反应，反应体系和扩增条件1.2.2。反应结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，然后挑取阳性克隆摇菌提取质粒，送测序公司进行测序。测序结果正确即获得重组的表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP。

1.2.4 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP在斑马鱼体内的表达 将表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP利用显微注射的方法注射到1-2细胞时期的斑马鱼受精卵中，置于培养皿在恒温培养箱中培养。培养条件：28℃，10∶14 h光周期，分别于注射12、24、40和72 h观察报告基因EGFP表达情况。

1.2.5 pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP的构建 将pMD18T/ MIPS质粒与pTgf2-EF1α-MCS-EGFP质粒利用ACSI和Xmal I（NEB）限制性内切酶分别进行双酶切，反应体系（20 μL）：pMD18-MIPS质粒或Tgf2-MCS质粒3 μL，ACSI和Xmal I各1 μL，buffer 4 3 μL，BSA 0.2 μL，H2O 11.8 μL，37℃酶切3 h，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，然后将回收的MIPS片段与pTgf2-EF1α-MCS-EGFP质粒大片段进行连接反应，反应体系和条件同1.2.3，然后转化，挑取阳性克隆利用引物Tgf2-F（5'-ACAAGACGCTTACAGGCTGAATG-3'）和Tgf2-R（5'-CTTCCCATTCTAAACAACACCC-3'）进行菌斑PCR反应，反应体系同1.2.2，扩增条件为：95℃ 5 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环，72℃ 7 min；反应结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，挑取阳性克隆摇菌提取质粒，送测序公司进行测序。测序结果正确即获得重组的表达载体pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP。

1.2.6 pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP质粒在斑马鱼体内的表达

1.2.6.1 荧光观察 将表达载体pTgf2-EF1α-MIPSEGFP利用显微注射的方法注射到1-2细胞时期的斑马鱼受精卵中，置于培养皿在恒温培养箱中培养。培养条件：28℃，10∶14 h光周期，分别于注射12、24、40和72 h观察报告基因EGFP表达情况。

1.2.6.2 靶基因MIPS的PCR检测 注射重组表达载体pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP的斑马鱼中表达EGFP阳性个体人工养殖3个月后，剪取转基因鱼和野生型对照斑马鱼的尾鳍提取DNA，对靶基因MIPS进行PCR检测（正向引物：5'-TTGGCGCGCCATGCCTGAGAAA-GTTCGTATC-3'，反向引物：5'-TCCCCC CGGGTTATGAGACTGTATGTCGAATCTTC-3'），反应体系同1.2.2，扩增条件为：95℃ 5 min，95℃ 30 s、55.6℃ 30 s、72℃ 83 s，35个循环，72℃ 7 min；反应结束后，产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，比较转基因鱼和对照鱼是否有目的条带来判断MIPS基因是否整合到了斑马鱼基因组中。本研究所有分子试验操作参考《分子克隆实验手册》［18］。

2 结果

2.1 MCS序列的PCR扩增与克隆

本试验设计的MCS长度为121 bp，经PCR扩增成功获得双链的MCS序列，将其克隆至PMD18-T质粒中，菌落PCR及其测序均证实本研究设计的MCS序列有效（图2）。

2.2 重组表达载体pTgf2-EF1α-MCS-EGFP在斑马鱼中的表达

通过PCR方法获得长度为121 bp 的MCS序列，再通过酶切、连接等方法将MCS序列构建到原始Tgf2质粒中（图3）。图4是注射pTgf2-EF1α-MCSEGFP质粒的斑马鱼体内12、24、40、72 h后报告基因EGFP的瞬时表达荧光观察结果。

2.3 重组表达载体pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP在斑马鱼中EGFP的表达

通过显微注射将重组表达载体pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP注射到斑马鱼中，分时段观察EGFP在斑马鱼中瞬时表达情况。图5是注射pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP质粒的斑马鱼体内12、24、40、72 h后报告基因EGFP的瞬时表达荧光观察结果。

2.4 重组表达载体pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP在斑马鱼中的PCR验证

取人工养殖3个月的EGFP表达阳性斑马鱼和野生型对照斑马鱼尾鳍提取DNA，利用引物ACSIS10和XmalI-S10进行目的基因MIPS的PCR检测。图6是40尾斑马鱼的PCR检测结果，MIPS基因大小为1 660 bp。图6结果显示基因编码区能够完整的整合到斑马鱼基因组中，说明Tgf2介导的转基因载体在斑马鱼中也有较高的转基因效率。

3 讨论

近年来由转座子介导的转基因技术已成为分子遗传育种中的主流技术，不仅能使鱼类的优良基因得到传递，也能使鱼类产生新的变异，同时还能筛选出鱼类一些重要性状的主控基因［5］以及进行增强子捕获等研究［19］。例如，Fujimura等［20］利用Tol2转座子获得转基因罗非鱼；Huang等［21］通过Tol2转座子介导的增强子捕获技术成功构建了心肌特异性表达GFP的转基因斑马鱼；Szeverenyi等［22］利用转座子标签法鉴定水稻的功能基因。金鱼Tgf2转座子作为hAT转座子家族的新成员具有自主转座活性，并与青鳉鱼Tgf2转座子相似度达97%，表明Tgf2转座子也可以作为鱼类转基因和增强子捕获的研究［11，23］，有关Tgf2转座子在鱼类转基因中的应用报道还很少，只有郭秀明［12］等利用金鱼Tgf2转座系统在团头鲂成鱼基因组中的表达以研究其插入的效率，结果显示整合效率为31.5%，拷贝数至少为2个。

之前载体改造中MCS序列一般都是通过分子克隆获得，这样的序列不仅不能满足大部分载体改造者的需求，如目的基因和MCS序列中没有相同的酶切位点等，还会存在将MCS序列插入原始载体后出现排斥的现象，如目的基因不能表达［24，25］。本文是人工设计并合成一段符合特定需求的MCS序列并构建到金鱼Tgf2表达载体中，即在原始Tgf2质粒EF1α启动子下游和报告基因EGFP上游区间插入MCS序列。由于MCS序列在EGFP基因的前面，当pTgf2-EF1α-MCS-EGFP注射到斑马鱼中，可以通过能否看到报告基因EGFP的表达来判定此改造是否可行。将构建得到的重组表达载体注射到斑马鱼中进行载体的功能验证，一方面在胚胎发育的不同时期都看到了EGFP的表达，构建的含有人工合成MCS序列的pTgf2-EF1α-MCS-EGFP载体能够在宿主体内正确表达，表明该MCS序列并没有影响报告基因的正常编码，重组载体是有效的。MIPS插入MCS序列中GFP能够表达，只是荧光强度减弱。由于原始载体中只有一个EF1α启动子，当一个启动子启动两个基因表达的时候势必会减弱后续基因的表达效率，所以pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP的EGFP的表达亮度会弱一些，可以在报告基因EGFP前再插入一个启动子来解决荧光表达弱的这个问题；另一方面也进行了PCR检测，共检测转基因斑马鱼86尾，其中含有靶基因MIPS的转基因个体为27尾，整合效率达31.4%。

4 结论

本研究是为了解决大多数外源目的基因编码序列无法插入到一些商业化载体中进行基因功能验证的不足而人为设计并合成了一段含有11个酶切位点的MCS序列，序列中添加的ATAT结构能够防止各不同内切酶对酶切位点的识别错误，同时也防止了较多GC碱基所引起的甲基化作用。GGAACC序列为随机添加，能够平衡上下游PCR扩增引物之间的退火温度和GC含量，利于后续扩增。再将其克隆至金鱼Tgf2表达载体并注射到斑马鱼中通过观察斑马鱼中EGFP的表达情况以及外源基因MIPS在斑马鱼体内的整合情况验证其有效性，以此解决大多数外源目的基因编码序列无法插入到一些商业化载体中进行基因功能验证的不足。

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（责任编辑 李楠）

Tgf2 Transposon Multiple Cloning Sites Cloning and Expression

Tao Ran1，2Chang Yumei2Liang Liqun2Tang Ran2Dou Xinjie2，3Wang Nan2，3Li Mingyun1
（1. College of Ocean，Ningbo University，Ningbo 315211；2.China National & Local United Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding，Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding，Ministry of Agriculture，Heilongjiang River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Harbin 150070；3. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

The goldfish pTgf2-EF1α-EGFP transposon vector was reconstructed by insertion of artificial synthesized multiple colning sites（MCS）. In order to examine its effectiveness, the recombinant vectors of pTgf2-EF1α-MCS-EGFP and pTgf2-EF1α-MCS-MIPS--EGFP containing the exogenous gene, Myo-inositol-3-phosphate synthase（MIPS）were injected into 1-2 cells of zebrafish embryos. Both fluorescence observation of GFP and PCR detection of exogenous gene sizes verified the effectiveness of the reconstructed vector, in spite of slight differences in fluorescent strength of GFP. Moreover, the reconstructed vector has a higher integration efficiency（31.4%）in the genome of zebrafish based on the results. The successful construction of recombinant expression vector displays goldfish Tgf2 transposon can mediate exogenous gene expression in zebrafish and it would be useful to Tgf2 transposon in gene function research of fish.

Goldfish Tgf2 transposon MCS sequence Transgenic zebrafish

2013-10-08

国家重点基础研究发展计划（2010CB126305）, 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(HSY201205)

陶然, 女, 硕士研究生,研究方向: 鱼类基因工程育种; E-mail：taoran0227@163.com

李明云, 男 ,教授, 博士生导师, 研究方向：种质种菌工程、遗传育种和分子遗传，E-mail：limingyun@nbip.net；梁利群, 女, 研究员, E-mail：llq-1019@163.com