无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重链基因的克隆及原核表达

2014-04-08王培鲁义善王蓓汤菊芬蔡佳吴灶和简纪常

生物技术通报 2014年2期

王培鲁义善王蓓汤菊芬蔡佳吴灶和简纪常

（1.广东海洋大学水产学院，湛江 524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088；3. 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088；4. 仲恺农业工程学院，广州 510225）

王培1，2，3鲁义善1，2，3王蓓1，2，3汤菊芬1，2，3蔡佳1，2，3吴灶和2，3，4简纪常1，2，3

以灭活的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）诱导后的吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）为材料，构建其头肾SMART cDNA文库，应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼（O. niloticus）分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp，开放阅读框（ORF）为1 740 bp，5'端非编码区（5'-UTR）41 bp，3'端非编码区（3'-UTR）140 bp，编码579个氨基酸，N端有信号肽结构。预测分子量（MW）为64.26 kD，理论等电点（pI）为5.36。系统进化树分析显示，吉富罗非鱼（O. niloticus）sIgM与牙鲆（Paralichthys olivaceus）和军曹鱼（Rachycentron canadum）的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼（O. niloticus）sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a（+）中，构建原核表达质粒pET28-sIgM，诱导表达后确定最优条件为37℃条件下，IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析，sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合，表明目的蛋白成功表达。

吉富罗非鱼免疫球蛋白M 基因克隆原核表达蛋白免疫印迹

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是免疫系统中重要组成部分。硬骨鱼类中，目前只发现了IgM、IgD、IgZ/IgT及一个嵌合体IgM-IgZ［1］，它们在体液免疫应答中起到最重要的介质作用。IgM是硬骨鱼类中最常见的免疫球蛋白分子，大多数是由四聚体组成，而每个亚基都包含一对共价连接的重轻链二聚体［2］。硬骨鱼类的IgM有分泌型（Secretory form of IgM，sIgM）和膜结合型（Membrance-bound，mIgM）两种形式，它们的重链（IgH）由相同基因编码，但由于mRNA前体加工过程决定重链基因的合成与表达形式［3］，因此，这两种形式的IgM恒定区也不完全相同，在分泌型IgM中存在4个恒定区，而在膜结合型IgM分子中则只有3个恒定区和一个位于CH3下游的跨膜结构（Transmembrane domain，TM）［4］。sIgM由血浆细胞产生并分泌于体液中，而mIgM分子则存在于B细胞质膜表面，作为特异性抗原结合受体［5，6］。前者是机体进行体液免疫中的重要组成部分，在研究鱼类病害防治及免疫预防方面具有重要意义。

吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）是世界水产业重点培养的淡水养殖鱼类，通常生活于淡水中，也能生活于不同盐分含量的咸水中，具有较高的食用及经济价值。但近年来饱受链球菌病的困扰，其中无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是引起养殖鱼类爆发链球菌病的主要病原之一，深入探讨无乳链球菌诱导后宿主免疫分子的波动规律，对链球菌疫苗的评价尤为重要。本研究拟从免疫球蛋白入手，对经灭活无乳链球菌诱导后，吉富罗非鱼（O. niloticus）分泌型IgM重链基因进行克隆与分析，并对其蛋白的原核表达条件进行优化，期望从分子角度为罗非鱼免疫防治及病害控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用吉富罗非鱼（体质量约100 g）由广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地提供。总RNA提取试剂盒是生工生物工程（上海）股份有限公司的产品，RACE所用试剂盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司，pMD-18T vector购自宝生物工程（大连）有限公司，大肠杆菌DH5α由本实验室保存，本研究所用的所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA文库的构建用经灭活的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）ZQ0910株免疫吉富罗非鱼，24 h后取其头肾，按照RNA提取试剂盒说明书提取罗非鱼总RNA。取2 μL用于琼脂糖凝胶电泳检测，用反转录试剂盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit合成cDNA文库，-20℃保存。

1.2.2sIgM片段扩增根据已知的其他鱼类的IgM恒定区保守序列设计两条简并引物MF/MR（表1），以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，运行35个循环，72℃延伸8 min。将所得的目的片段回收纯化并连接到pMD-18T载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态中，筛选单克隆，经菌落PCR检测为阳性后测序验证。

1.2.3 RACE扩增sIgM全长序列根据得到的sIgM中间片段序列，分别设计5'巢式引物5-MSP1、5-MSP2和3'巢式引物3-MSP1和3-MSP2。经两轮PCR反应扩增出5'端和3'端片段。首轮反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性60 s，66℃退火60 s，72延伸70 s，运行10个循环，每个循环降1℃；94℃变性60 s，56℃退火60 s，72℃延伸70 s，运行20个循环；72℃延伸10 min。将首轮PCR产物稀释10倍作为第二轮PCR反应的模板，反应条件与首轮反应相同。纯化回收目的片段，连接、转化、筛选单克隆及测序。

1.2.4 序列拼接及分析对测序后所得的序列进行多种生物信息软件的分析。首先，在GenBank数据库中进行序列同源性比对和相似性分析；再通过DNAMAN软件进行拼接，得到sIgM基因的全长，利用ORF Find在线软件进行ORF的预测，使用ExPASy软件将核酸翻译成氨基酸序列；在InterProScan Sequence Search网站进行蛋白质结构功能域分析，确定sIgM的可变区和恒定区；通过在线分析工具NeTPhos2.0Server和NeTOGlyC3.1Server分别对罗非鱼sIgM的磷酸化位点和O-糖基化位点进行预测。SignalP 3.0 Server在线网站进行信号肽预测；通过在NCBI上搜索IgM恒定区的同源序列，使用Clustal X2.0软件对吉富罗非鱼sIgM恒定区和其他硬骨鱼类的IgM恒定区结构域进行多序列比对；采用MEGA4.0软件完成系统进化分析，邻位相连法（Neighbor-joining）构建系统进化树。

1.2.5 吉富罗非鱼sIgM基因恒定区原核表达载体的构建根据已获得的sIgM基因cDNA全长序列，设计一对特异性sIgM恒定区表达引物M-μ-F 和M-μ-R，并在两条引物的5'端引入BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点。通过常规PCR扩增sIgM恒定区序列。回收、连接、转化、筛选单克隆，测序验证。

将测序正确的菌液抽提质粒，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切该质粒和pET-28a（+）质粒，用T4连接酶将酶切后的产物连接，构建重组质粒pET-sIgM。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态中，涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，筛取单克隆PCR菌落鉴定，测序验证。

1.2.6 大肠杆菌诱导表达及表达条件的优化将测序正确的菌液以1∶100比例接种于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4-0.6，加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5 mmol/L，于37℃继续震荡培养4 h。取1 mL菌液10 000 r/min离心收集菌体，处理样品，SDS-PAGE分析。

在37℃和28℃条件下（IPTG浓度为0.2 mmol/ L）诱导4 h，分别离心菌体并超声破碎，将离心后的上清液和下沉液进行SDS-PAGE电泳分析；IPTG浓度分别为0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，37℃诱导4 h，处理样品，SDS-PAGE分析；诱导时间分别为0.5、1、2、3、4 h，5、6和7 h，37℃，IPTG浓度为0.05 mmol /L，处理样品，SDSPAGE分析；用解离非连续缓冲系统垂直板电泳，丙烯酰胺浓度：分离胶12%（V/V），浓缩胶5%（V/V）。每孔上样7 μL，浓缩胶以80 V电压通电30 min，分离胶以120 V电压通电1 h，染色，脱色。

1.2.7 重组融合蛋白的提取与纯化将按照最优表达条件诱导后的菌液离心后用PBS重悬，于冰上超声破碎，破碎程序为功率200 W，超声破碎时间6 s，间隔8 s，直至菌液澄清。离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。采用HisTrapTMHP亲和层析柱纯化蛋白，分别用含30、50、75、100、150、200、250和300 mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脱样品，并分别收集样品。

1.2.8 Western blot检验将纯化后的sIgM融合蛋白经SDS-PAGE电泳后，按常规方法进行蛋白转移。4℃，70 mA转印约150 min。5%脱脂牛奶37℃封闭3 h，加入一抗（鼠抗His单克隆抗体，1∶2 000稀释）孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min；然后，加入二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG，1∶500稀释）孵育1 h，再用TBST清洗3次，每次10 min；最后加入DAB显色液，待出现明显条带后立即用ddH2O终止反应。

2 结果

2.1 sIgM片段扩增结果

利用简并引物进行PCR扩增，获得约500 bp的一段序列，测序后在GenBank中进行BLAST检索，确认为sIgM其中一部分序列。

2.2 3'端和5'端RACE

根据设计的特异性引物按照试剂盒说明分别进行3'端和5'端RACE扩增，得到与预期相符合的目的条带（图1），测序后得到的基因片段大小分别为1 280 bp和591 bp。

2.3 罗非鱼sIgM 重链基因全长cDNA序列

将得到的中间片段序列3'RACE和5'RACE序列进行拼接，获得1 921 bp的罗非鱼sIgM全长序列（GenBank登录号：KF305823）。该序列含有一个能编码579个氨基酸的1 740 bp的开放阅读框（Open reading frame，ORF），以及5'末端41 bp的非编码区（5'-UTR）和3'末端140 bp的非编码区（3'-UTR）。其中3'端非编码区包含终止密码子TAA和一个polyA加尾信号：AATAAA。根据预测的氨基酸序列，预测罗非鱼sIgM的理论等电点（pI）为5.36，理论分子量为64.26 kD。利用SignalP 3.0 Server网站对sIgM氨基酸序列进行N端信号肽预测发现，1-19氨基酸处为信号肽。TMHMMOL/L Server v. 2.0软件预测该序列不存在跨膜区结构。通过在线分析工具分别对罗非鱼sIgM氨基酸序列进行分析，发现该蛋白序列含有30个磷酸化位点和4个O-糖基化位点。蛋白质结构功能域分析，确定sIgM有一个可变区（VH）、一个连接区段（JH）和4个恒定区（CH）。将吉富罗非鱼的sIgM基因恒定区氨基酸序列与红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）、斑马鱼（Danio rerio）、大马哈鱼（Oncorhynchus mykiss）、黄尾鱼（Plecoglossus altivelis）、南极岩斑鳕鱼（Notothenia coriiceps）、头带冰鱼（Chaenocephalus aceratus）及团头鲂（Megalobrama amblycephala）的sIgM恒定区氨基酸序列进行序列相似性对比（图2），发现每个恒定区几乎都含有保守的半胱氨酸和色氨酸。根据不同鱼类的IgM氨基酸序列构建的系统进化树显示（图3），吉富罗非鱼IgM与牙鲆（Paralichthys olivaceus）和军曹鱼（Rachycentron canadum）亲缘关系较近。

2.4sIgM基因恒定区的克隆及原核表达载体构建

根据设计的罗非鱼sIgM恒定区引物，得到1 338 bp的恒定区片段。测序后证实为sIgM目的序列。将sIgM基因的目的片段与pMD-18T载体连接，筛选阳性克隆，酶切回收片段，目的片段与pET-28a（+）载体连接后转化，菌落PCR鉴定及测序验证pET28-sIgM重组质粒构建成功（图4）。

2.5 重组质粒的诱导表达及表达条件的优化

将重组质粒pET28-sIgM转化入E.coliBL21，经诱导条件（37℃，0.5 mmol/L IPTG，4 h，OD6000.4-0.6）诱导后，可以表达出52.37 kD左右的融合蛋白（图5），而sIgM恒定区的蛋白分子量为49.37 kD，标签蛋白pET-28a的分子量约为3 kD。将经过不同诱导条件诱导的重组质粒与未经诱导的重组质粒分别进行SDSPAGE分析（图6）。通过对温度、IPTG浓度、和时间的优化，确定重组质粒pET28-sIgM最佳诱导条件为37℃条件下，IPTG浓度为0.05 mmol/L，诱导4 h。从图6-A中可以看到，细菌超声破碎后，重组蛋白主要存在于沉淀中，而在上清液中几乎不存在。因此，重组融合蛋白主要是以包涵体的形式表达。

2.6 重组质粒的纯化及鉴定

在最佳诱导条件下诱导pET28-sIgM重组蛋白，收集菌体，提取包涵体，将蛋白样品用HisTrapTMHP亲和层析柱进行纯化。分别采用不同浓度的咪唑缓冲液洗脱，收集后进行SDS-PAGE电泳检测，图7-A显示在200 mmol/L咪唑浓度条件下洗脱纯化效果最好。用K4000 Bradford蛋白质定量试剂盒测定洗脱液的蛋白浓度为490 μg/mL 。Western blot分析（图7-B）显示，纯化后的sIgM重组融合蛋白可以与His-Tag单克隆抗体结合，蛋白大小和融合蛋白大小一致，结合测序结果推断，已成功表达出吉富罗非鱼sIgM蛋白。

3 讨论

在硬骨鱼类已经报道的免疫球蛋白中，IgM作为最重要的一类免疫球蛋白，在鱼类的体液免疫中发挥着重要的作用。而IgM以两种形式存在：一是存在于血液和其他体液中的分泌型Ig（sIgM），二是存在于细胞表面作为抗原结合受体存在的膜结合型Ig（mIgM）；区别这两种类型的IgM关键在于其重链的C端，C端是疏水区则与细胞膜结合形成mIgM，C端为亲水区则形成sIgM。而这两种形式的Ig分子重链基因实际上由同一个基因编码，只是其mRNA前处理过程在两种形式Ig的分化中具有决定性的作用［7］。事实上，在哺乳类、鸟类中，mIgM的产生是由TM直接与CH4外显子中剪切位点相连。而大部分硬骨鱼类，其mIgM的产生主要由跨膜区直接连接到CH3外显子的一个隐蔽的剪切位点，从而形成膜结合型免疫球蛋白M［5，8］，这种剪切方式已经在很多种硬骨鱼中被证实［9-12］。对于以CH3-TM剪切方式产生的mIgM来说，由于这种剪切方式直接导致TM与CH3位点连接，从而使CH4被剪切掉，但连接到CH3的跨膜结构的分子量没有CH4分子量大，所以此种剪切方式所产生的mIgM重链分子量会明显小于sIgM的重链分子量［13］。而sIgM则是在IgM分子恒定区羧基端不存在这种剪切方式，但由于在CH4下游缺少一个附加的分泌域，硬骨鱼类的sIgM整个恒定区CH1-CH4一起被认为是一个分泌域［4］，共同决定sIgM的生物功能。因此，真正影响这两种形式的IgM的产生最主要的原因是其剪切方式的不同，也就是说只要弄清楚IgM分子的剪切方式即可判定IgM的分子类型。本研究采用在线分析软件对所得到的吉富罗非鱼IgM恒定区羧基端进行分析发现，其不含有跨膜结构（TM），而TM是区分分泌型和膜结合型两种IgM分子的重要标志。因此，本研究所得的罗非鱼IgM应为分泌型IgM。虽然吴铁军等［14］早在2009年已经对罗非鱼IgM重链基因进行克隆，但并没有对罗非鱼物种做出细化的分析，也没对所得的IgM重链基因进行分型和基因的编码形式做出分析。因此，本研究在前人所作研究的基础上，从吉富罗非鱼头肾cDNA文库中首次扩增出sIgM重链基因序列，并通过生物信息学及分子生物学方法对其进行分析发现，吉富罗非鱼sIgM基因的基本结构形式为Leader-VH-JH-CH1-CH2-CH3-CH4。

本研究中，将所得到的罗非鱼的sIgM基因序列及所编码的氨基酸序列与GenBank中其它鱼类IgM基因及氨基酸序列进行BLAST分析，结果显示吉富罗非鱼sIgM与其它已知物种的sIgM具有较高的同源性。罗非鱼的sIgM基因包含一个多变区（VH），一个连接区段（JH），4个典型的恒定区（CH），几乎每个恒定区都含有一个与二硫键连接的半胱氨酸和一个稳定三级结构的色氨酸，其位点都相对保守，其中第一个恒定区（CH1）含有两个半胱氨酸，而第一个半胱氨酸具有与IgM轻链连接的作用［15］。在sIgM蛋白序列的N端还有一个由19个氨基酸组成的信号肽序列，该信号肽位于分泌蛋白的N末端，可以引导新生肽穿越质膜，对外分泌蛋白的分泌起重要作用［16，17］。

外源蛋白的原核表达是最快捷、最经济的获得目的蛋白的表达方法，而大肠杆菌原核表达系统操作简单、价格低廉，因此在研究各种蛋白功能时，原核重组是重要的试验方法［18］。本研究利用含有T7启动子的pET-28a（+）原核表达载体成功表达出融合蛋白pET28-sIgM，经诱导表达后，蛋白表达量有所提高［19］。为了得到更多的目的蛋白，本试验采用单因素法分别从温度、IPTG诱导浓度和时间三方面对pET28-sIgM重组表达载体进行诱导表达，从而选择出最优诱导条件。由于温度影响酶反应速率，因此在37℃条件下sIgM重组蛋白显著表达。IPTG不仅具有诱导蛋白表达的功能，还对菌体代谢产生毒性作用，因此选择IPTG最低有效浓度，可以降低不必要的代谢产物影响蛋白性质［20］。在确定温度和诱导剂的浓度时，随着时间的加长，蛋白表达量显著增加，当达到顶峰时，蛋白表达量开始下降，这表明时间也是控制蛋白表达的重要因素。综上所述，最终确定在37℃条件下，IPTG浓度为0.05 mmol/L诱导4 h时重组蛋白表达量最高。在大量成功表达出融合蛋白sIgM后，发现在表达产物中重组蛋白主要以包涵体的形式存在。而包涵体是由重组蛋白、外膜蛋白、DNA、肽聚糖等杂体组成［21］。由于pET28a（+）表达载体具有6个His标记，因此通过HisTrapTMHP亲和层析柱进行纯化，得到高纯度的重组融合蛋白。Western blot显示，sIgM重组蛋白与鼠抗His-Tag发生特异性结合，说明成功获得罗非鱼sIgM重组融合蛋白。

4 结语

本研究成功克隆出吉富罗非鱼sIgM重链基因序列，其结构、组成以及功能域与其它硬骨鱼类免疫球蛋白家族类似。通过原核表达获得重组蛋白，对后续制备多克隆抗体用于罗非鱼免疫机制的研究提供了重要的依据。

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（责任编辑李楠）

Cloning and Prokaryotic Expression of Secretory Form of Immunoglobulin M（sIgM）Heavy Chain Gene in GIFT Strain of Nile Tilapia（Oreochromis niloticus）Induced by Streptococcus agalactiae

Wang Pei1，2，3Lu Yishan1，2，3Wang Bei1，2，3Tang Jufen1，2，3Cai Jia1，2，3Wu Zaohe2，3，4Jian Jichang1，2，3
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；3. Guangdong Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；4 .Zhongkai University of Agriculture and Engineering，GuangZhou 510225）

GIFT strain of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）, induced by inactivated Streptococcus agalactiae, was used to construct the head kidney cDNA library. The full-length sIgM cDNA of Nile Tilapia was cloned using homological cloning and rapid amplification of cDNA ends（RACE）methods. Results showed the full-length of sIgM cDNA was 1 921 bp, containing a 5' untranslated region（5'-UTR）of 41 bp, a 3'-UTR of 140 bp and an open reading frame of 1 740 bp encoding 579 amino acids with an estimated molecular weight of 64.26 kD and an estimated isoelectric point of 5.36. In the N-terminal of sIgM exists a signal peptide structure. The phylogenetic trees constructed showed that sIgM of Nile tilapia shared the closest relationship with the corresponding proteins of Paralichthys olivaceus and Rachycentron canadum. The sIgM had four CH domains. The constant segment of sIgM gene was amplified and inserted into the pET-28a（+）vector to construct the prokaryotic expression plasmid pET28a-sIgM. The optimal expression condition was set as 0.05 mmol/ L IPTG, induced temperature 37℃, and induced time 4 hours.The recombinant sIgM fusion proteins was purified by His TrapTMHP column, and then identified by western blot using His-Tag Mouse mAb.

GIFT strain of Nile tilapia Immunoglobulin M Gene cloning Prokaryotic expression Western blot

2013-09-30

国家自然科学基金项目（41240041），广东省科技计划（2012B020308010），广东省教育厅育苗项目（B12123）

王培，女，硕士研究生，研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制；E-mail：wangpei1108@163.com

简纪常，博士，教授，研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制；E-mail：jianjc@gmail.com