牡丹WD40类转录因子基因PsWD40-1和PsWD40-2的分离与序列分析

张超 高树林 杜丹妮 吴凡 董丽

（北京林业大学园林学院 国家花卉工程技术研究中心，北京 100083）

牡丹WD40类转录因子基因PsWD40-1和PsWD40-2的分离与序列分析

张超 高树林 杜丹妮 吴凡 董丽

（北京林业大学园林学院 国家花卉工程技术研究中心，北京 100083）

利用已构建的牡丹‘洛阳红’花瓣转录组数据库，筛选得到2个与植物花青素苷合成WD40蛋白同源性较高的Unigene序列，分别命名为PsWD40-1和PsWD40-2。利用RT-PCR技术，设计特异性引物对PsWD40-1和PsWD40-2最大阅读框（ORF）序列进行扩增，测序结果表明PsWD40-1序列包含一个1 035 bp的ORF，编码一个344 aa的肽链；PsWD40-2序列包含一个1 032 bp的ORF，编码一个343 aa的肽链。牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推测所编码蛋白序列均具有典型的WD40结构域。PsWD40-1蛋白序列与葡萄VvWDR2相似性为96%，PsWD40-2蛋白序列与葡萄VvWDR1相似性为87%。系统进化树分析发现，PsWD40-1与葡萄VvWDR2、拟南芥AtAN11、陆地棉GhTTG2等序列聚在MP1分支，而PsWD40-2与葡萄VvWDR1、矮牵牛PhAN11、紫苏PfWD40等序列聚在另一分支TTG1/PAC1分支。

牡丹 花青素苷合成 调节基因 WD40蛋白

花青素苷（Anthocyanins）是一类水溶性的类黄酮化合物，广泛分布于植物细胞液泡中，它决定了大部分观赏植物花瓣呈现出五彩缤纷的颜色［1］。已有研究表明，植物花青素苷的生物合成受结构基因和调节基因的共同调控［2］，目前已分离和鉴定了3大类花青素苷合成的转录因子：MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白［3］。

WD40也称WDR（WD repeat）蛋白是一类古老的蛋白家族，其结构高度保守。一般含有4-16个串联重复的WD基元，每个WD基元由40个氨基酸残基组成［4］。目前已从拟南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、矮牵牛（Petunia hybrida）、石榴（Punica granatum）、桃（Prunus persica）、玉米（Zea mays）、紫苏（Perilla frutescens）等植物中分离到编码WD40蛋白的部分基因［5-11］。但是未见牡丹（Paeonia suffruticosa）中WD40基因的相关研究报道。本研究利用已构建的牡丹花瓣转录组数据库，结合RT-PCR技术，获得2个WD40基因PsWD40-1和PsWD40-2的cDNA序列，同时分析了这2个基因推定的氨基酸序列及其与其他物种WD40蛋白序列的同源性，为揭示牡丹花青素苷生物合成奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

牡丹‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa‘Luoyang Hong’）1级［12］花朵取自河南省洛阳花木公司牡丹苗圃地，采后运回北京林业大学园林学院花卉生理和应用实验室。用锡箔纸将花朵中瓣包好后液氮速冻，并保存于- 80℃冰箱用于后续试验。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA第一链合成 采用CTAB法［13］提取牡丹花瓣总RNA。以提取的总RNA为模板，Oligo（dT）15为引物，利用Promega公司的M-MLV反转录酶合成cDNA第一链。

1.2.2 RT-PCR扩增、PCR产物回收及测序 前期本课题组已构建牡丹花瓣转录组数据库，从中筛选出2个与花青素苷合成有关的WD40序列Unigene27730和CL7982.Contig1， 分 别 命 名 为PsWD40-1和PsWD40-2。设计特异性引物F1（5'-CTTACACACACTGAAACTAAAAAA-3'）和R1（5'-GATAAAGGAAGACATGAAACACA-3'）、F2（5'-CCACATATTAAAAAGAACAAGAGC-3'）和R2（5'-CAAGAAAAAATGAATCCGGG-3'），以合成的cDNA第一链为模板分别对PsWD40-1和PsWD40-2基因的最大阅读框（Open reading frame，ORF）序列进行扩增。25 μL反应体系：10 × buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/μL）0.5 μL，上下游引物（10 mmol/μL）各1 μL，cDNA 1 μL，TaqDNA 聚 合 酶（5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 18.6 μL。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，与pGEM-T载体（Promega）连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，经PCR和酶切鉴定后送北京奥科生物技术有限责任公司测序。

1.2.3 序列分析

测序获得的序列通过NCBI提供的ORF Finder进行ORF查找，序列翻译、氨基酸序列比对采用DNAMAN 6.0软件进行。通过ExPASy ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）预测所编码蛋白的分子量、理论等电点。使用MEGA 5.05软件中的Neighbor-Joining（邻位相连法，NJ）法建立系统进化树。

2 结果

2.1 牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因的ORF序列分离

对本课题组前期构建的牡丹‘洛阳红’花瓣转录组数据库（结果未发表）进行分析，发现其中有65个Unigene与WD40基因同源性较高（表1）。进一步序列比对发现，Unigene27730和CL7982. Contig1经Blastx比对得到的结果分别为“WD repeat 2（Vitis vinifera）”和“transparent testa glabra 1（Prunus persica）”，推测这2个Unigene序列（分别命名为PsWD40-1和PsWD40-2）可能与参与花青素苷生物合成的WD40蛋白有关（图1），利用特异性引物F1和R1、F2和R2分别对PsWD40-1和PsWD40-2基因ORF序列扩增（图2），获得预期大小1 200 bp和1 100 bp左右的条带。

2.2 牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因核苷酸和推测所编码蛋白的分析

测序结果（表2）表明，PsWD40-1序列包含一个1 035 bp的ORF，编码一个344 aa的肽链，理论分子量为38.78 kD，等电点为4.65；PsWD40-2序列包含一个1 032 bp的 ORF，编码一个343 aa的肽链，理论分子量为38.50 kD，等电点为4.95。

牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推测所编码蛋白序列对比结果显示2个蛋白均具有4个典型的WD40结构域（图3）；PsWD40-1和PsWD40-2蛋白与葡萄和拟南芥的WD40蛋白间有较高的相似性，

其中PsWD40-1与葡萄VvWDR2相似性为96%，PsWD40-2与葡萄VvWDR1相似性为87%。

2.3 牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因编码蛋白的同源性分析

PsWD40-1和PsWD40-2蛋白与其他物种WD40蛋白构建系统进化树（图4），进化树总体上分为两个分支：TTG1/PAC1和MP1。PsWD40-1与VvWDR2、AtAN11、GhTTG2等序列聚在MP1分支， 而PsWD40-2与VvWDR1、PhAN11、PfWD40等序列聚在另一分支（TTG1/PAC1分支），其中牡丹PsWD40-1与葡萄VvWDR2蛋白同源性最高，牡丹PsWD40-2与葡萄VvWDR1蛋白同源性最高。

3 讨论

WD40蛋白序列以N端11-24个残基处GH二肽（Gly-His，GH）开始，C末端以WD氨基酸（Trp-Asp，WD）结尾，因此称为WD40蛋白［4，10］。最典型WD40蛋白是异源三聚体G蛋白的Gβ亚基，Gβ亚基由7个扇叶组成的螺旋桨结构，包含7个WD40基元［3］。这一类古老的蛋白家族结构高度保守，其具有4个保守WD40结构域，序列在不同植物中也十分保守。本研究分离得到的PsWD40-1和PsWD40-2基因所推测编码的蛋白序列也具有WD40蛋白家族典型的4个保守WD40结构域（图3），表明牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因为WD40类转录因子基因。

目前，拟南芥WD40蛋白家族研究较为深入。拟南芥WD40类蛋白TTG1调控多个植物发育和生化途径，其中包括根毛、种皮、茎叶表皮毛的形成和发育，以及植株花青素苷和原花青素苷的合成与积累等［3，15-18］。系统进化树分析发现PsWD40-1和PsWD40-2蛋白分别聚在MP1和TTG1/PAC1分支。TTG1/PAC1分支还包括其他已知在转录水平上调控花青素的生物合成途径的WD40蛋白，如葡萄VvWDR1［7］、矮牵牛PhAN11［19］、拟南芥AtTTG1［3］、紫苏PfWD40［8］、玉米ZmPAC1［9］等，推测PsWD40-2基因可能参与调控牡丹花青素的生物合成。而与牡丹PsWD40-1蛋白同源性最高的葡萄VvWDR2，在拟南芥中异源表达并未提高转基因拟南芥花青素苷含量［7］。因此PsWD40-1和PsWD40-2基因是否在转录水平上调控牡丹花青素的生物合成，其生物学功能的揭示需要进一步开展大量研究工作。

4 结论

本研究利用已构建的牡丹花瓣转录组数据库，结合RT-PCR技术，获得2个WD40基因PsWD40-1和PsWD40-2的cDNA序 列。 牡 丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推测所编码蛋白序列均具有WD40蛋白家族典型的4个保守WD40结构域。PsWD40-1和PsWD40-2蛋白序列与其他物种调控花青素苷合成相关WD40蛋白同源性较高。

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（责任编辑 狄艳红）

Isolation and Sequence Analysis of the Paeonia suffruticosa WD40 Transcription Factor Genes PsWD40-1 and PsWD40-2

Zhang Chao Gao Shulin Du Danni Wu Fan Dong Li
（College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，National Flower Engineering Technology Research Center，Beijing 100083）

Two Unigene sequences that share high homology with WD40 protein involved in plant anthocyanin biosynthesis were obtained from previous-constructed tree peony（Paeonia suffruticosa ‘Luoyang Hong’）petal transcriptome database and named as PsWD40-1 and PsWD40-2. Sequences of open reading frame（ORF）in PsWD40-1 and PsWD40-2 were amplified with designed specific primers using RTPCR technology and sequenced. Results showed that PsWD40-1 contains a 1 035 bp ORF encoding 344 amino acid residues, and PsWD40-2 contains a 1 032 bp ORF encoding 343 amino acid residues. The predicted protein sequences of PsWD40-1 and PsWD40-2 genes both contain the typical WD40 structural domain. PsWD40-1 shares high similarity（96%）with VvWDR2 of Vitis vinifera, and PsWD40-2 shares 87% similarity with VvWDR1 of Vitis vinifera. Phylogenetic tree analysis showed that PsWD40-1 is grouped into the MP1 clade with VvWDR2 of Vitis vinifera, AtAN11 of Arabidopsis thaliana, and GhTTG2 of Gossypium hirsutum, while PsWD40-2 is grouped into the other clade, TTG1/PAC1 clade, with VvWDR1 of Vitis vinifera, PhAN11 of Petunia hybrida, and PfWD40 of Perilla frutescens.

Tree peony （Paeonia suffruticosa） Anthocyanin biosynthesis Regulatory gene WD40 protein

2013-09-09

高等学校博士学科点专项科研基金（20130014110014）

张超，男，博士研究生，研究方向：牡丹切花花色发育；E-mail：zhangchao24804@gmail.com

董丽，女，博士，教授，博士生导师。研究方向：鲜切花采后保鲜；E-mail：dongli@bjfu.edu.cn