环介导等温扩增技术在转基因水稻Bt63检测中的应用

张明哲陈曦徐俊锋陈吴健吴蓉吴志毅

（1.浙江省检验检疫科学技术研究院，杭州 310016；2.浙江省农业科学研究院，杭州 310021；3.杭州出入境检验检疫局，杭州 310012）

环介导等温扩增技术在转基因水稻Bt63检测中的应用

张明哲1陈曦1徐俊锋2陈吴健1吴蓉3吴志毅1

（1.浙江省检验检疫科学技术研究院，杭州 310016；2.浙江省农业科学研究院，杭州 310021；3.杭州出入境检验检疫局，杭州 310012）

采用环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）对转基因水稻Bt63进行应用检测。研究表明，环介导等温扩增技术检测转基因水稻Bt63特异性好，并且灵敏度达到0.01%（W/W），具有简便、快速、准确等特点，可以在进出口检验检疫、食品安全监测等领域进行应用。

环介导等温扩增技术 转基因水稻Bt63 检测

近年来，世界上转基因生物研发工作进展非常迅速，2012年全球转基因作物种植面积达到1.703× 108hm2，比2011年的1.6×108hm2增长了6%，较1996年增长了100倍［1］。随着转基因作物已被快速、持续地用于商业化生产，无论在发达国家还是发展中国家都产生了巨大的经济、能源、卫生及社会效益。但同时，转基因作物及其产品可能带来的环境、健康等问题也已引起世界性的所谓“生物安全”的论战。为此，许多国家相继制定了对转基因生物的管理法规，对进口转基因食品进行严格管理，要求出具转基因成分的检测报告，对转基因食品采用标识制度。我国于2001年5月23日颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，2001年9月5日开始实施《出入境转基因产品检验检疫管理办法》，2002年3月20日开始贯彻实行《农业转基因生物标识管理办法》。

随着各个国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度管理的加强，转基因检测的对象已经从原来的大豆、小麦、大米、土豆等农产品扩展到许多深加工的产品，如食用油脂、米制品、酱油、豆奶、酒、饲料等等，而这其中米制品一直是欧盟和其他一些国家关注的重点。2006年9月以来，已有法国、德国、意大利、奥地利和日本等7个国家因为转基因大米污染对我国出口米制品采取了拒绝入境或撤架、召回等措施。欧盟在2008年4月15日起对中国出口的大米及其米制品采取保障性措施，要求由中方认可的实验室对出口产品实施检测，并出具统一的卫生证书才能出口。而另一方面，我国对转基因作物培育的投入也逐年增加，近年来具有良好生长性能的转基因新品种不断涌现，2009年农业部审放了转基因耐除草剂水稻“Bt汕优63”等三个转基因农作物的生产应用安全证书，这标志着我国极有可能成为世界上第一个商业化种植转基因水稻的国家，因此如何快速便捷的检测转基因水稻已成为了当前热门的研究课题之一。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由Notomi 等［2］发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上6个区域的4条引物（2 条外引物，2 条内引物）及具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶，在65℃左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到109-1010个拷贝数量级。LAMP反应步骤可分为2个部分—哑铃状模板构造的形成（图1-A）与循环扩增（图1-B）。如图1-A所示，在65℃左右时，FIP引物在Bst酶作用下以F2 区段的3'末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3'末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边置换先头FIP 引物合成的DNA链，一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，这条单链在5'末端存在互补的F1c和F1区段，于是发生自我碱基配对，形成单边环状结构。同时这条单链DNA，又可作为模板，在另一端结合BIP引物和B3引物合成一条双链，并置换出一条单链DNA。此时，被置换的单链DNA两端都存在互补序列，自我碱基配对后整条链呈现哑铃状构造（图1-A）。上述过程中最后形成的哑铃状模板构造是循环反应的原料（图1-B）。在循环反应中，首先在哑铃状结构中，以3'末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA 合成延伸。与此同时，FIP 引物F2 与环上单链F2c 杂交，启动新一轮链置换反应。解离由F1 区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c，BIP 引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增。最终形成如花椰菜样的茎-环结构DNA组成的混合物，即由在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。整个反应仅需1 h，具有简便、快速、准确等特点。LAMP法广泛应用于包括病毒［3-5］、细菌［6-8］等传染性疾病的定性和定量检测。近年来，该技术逐渐开始用于转基因作物检测领域，如柳毅等［9］用于检测转基因大豆，张隽等［10］检测转基因玉米MON863，以及凌莉等［11］检测转基因玉米MIR602等一些报道，但用于转基因水稻检测的应用较少，本研究就是准备采用LAMP法对转基因水稻Bt63进行快速检测。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 转基因样品 转基因水稻品系Bt汕优63（简称Bt63）、科丰6号（KF6）、克螟稻（KMD1）为浙江省农业科学研究院馈赠；转基因玉米品系Bt176，转基因大豆品系GTS-40-3-2，转基因油菜籽品系GT73均购自欧洲标准局（IRMM）；非转基因水稻则购自国内市场。

1.1.2 材料制备 将转基因水稻Bt 63研磨（PHILIPS cucina blender HR2860）至粉末状（0.2 mm左右），并按表1比例混合转基因和非转基因的材料，分别获得50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%和0.001%含量的转基因样品。

1.1.3 仪器 OptiGene Limited GenieⅡ等温扩增检测系统（英国OptiGenie Limited 公司）；Sorvall micro21R台式冷冻离心机（Thermo）；数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；XS104 电子天平（Mettler Toledo）；Nano Drop 3300核酸测定仪（Thermo）；Milli-Q 超纯水系统（Millipore）等。

1.1.4 试剂 DNA提取试剂盒为QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit试剂盒；引物由宝生物工程（大连）有限公司（TAKARA）合成；扩增试剂来自于英国OptiGenie Limited 公司，荧光显色试剂来自于北京蓝谱生物科技有限公司，其它分析纯试剂购于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取都使用QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit试剂盒进行，DNA浓度由核酸测定仪（Nano Drop 3300）检测得到。

1.2.2 引物设计 根据GenBank及相关文献资料我们获得了转基因水稻Bt63转化体特异性序列，再根据网上软件工具Primer Explorer V4（http：// primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html） 设 计 选 择LAMP引物。由于涉及到专利和知识产权保护，引物序列在本文中不公开。

1.2.3 LAMP扩增 LAMP 反应体系与反应条件：25 μL体系内反应各组分终浓度为：内引物FIP和BIP 各0.8 μmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，dNTPs 400 μmol/L，1× ThermoPol Reaction Buffer，加入模板DNA后，95℃加热5 min后冰上冷却，再加入 Bst DNA 聚合酶大片段8 U。LAMP 反应条件：将LAMP 反应体系迅速置于63℃温度下反应1 h后，终止反应。如果进行荧光显色反应，在反应前加放入显色反应液，若是阳性扩增，在紫外光下则会发出荧光，若是阴性扩增，在紫外光下则不会发光。

2 结果

2.1 特异性验证

分别用LAMP体系对不同的作物进行了反应，紫外检测结果如图2所示。在紫外光下，只有6号和P号的管子中有荧光产生，其余均为阴性。其中6号为转基因水稻Bt63，P为阳性对照，而其它的转基因作物和阴性对照都没有扩增，说明LAMP的特异性很好，同时GenieⅡ的扩增结果也证明了这点（图3）。

2.2 灵敏度试验

为验证LAMP检测转基因水稻Bt63方法的灵敏度，分别配制含有转基因水稻Bt63 50%、10%、5%、1%、0.1%和0.01%的百分比浓度样品，模板量为50 ng，扩增结果如图4、图5所示。0.01%浓度的转基因检测都有阳性信号出现，而0.001%浓度的转基因检测无阳性信号出现。3次重复检测显示，0.01%浓度的检测结果基本稳定，因此认为本试验中LAMP检测转基因水稻Bt63的灵敏度为0.01%。

3 讨论

虽然目前检测转基因作物有多种方法，包括蛋白质类相关检测技术［12，13］、化学物质指纹图谱检测技术以及核酸类检测相关技术［14-17］，但是由于试剂成本与制备时间等原因，核酸类检测技术应用更加广泛。PCR 和荧光 PCR 法仍然是最常用以及最适用的检测转基因食品的方法［18-22］，国内众多行业标准与国家标准均是以 PCR 或荧光定量 PCR 作为技术平台。但是普通 PCR 法需要进行凝胶电泳，操作繁琐且容易污染，而荧光定量 PCR 虽然检测灵敏度高、重复性较好，但是该方法用到的仪器和试剂都很昂贵，难以适应日益普及和多元化发展的检测需求。

本研究建立的环介导等温核酸扩增法检测转基因水稻Bt63的方法，同PCR 技术相比具有较大优势：（1）操作简便，反应不需要复杂的仪器，只需一个维持恒定温度的金属加热块或者水浴锅就能反应；（2）快速高效，检测灵敏度高，整个扩增1 h 即可完成，如果在反应中加入环状引物还可以促进扩增，减少反应时间；（3）特异性高，该技术由4 条引物扩增靶序列的6个区段，具有高度特异性，不易出现假阳性结果；（4）反应整个过程可以闭管操作，可以从源头上控制气溶胶污染。因此，LAMP技术检测转基因水稻Bt63的方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便、快速等特点，可以在进出口检验检疫、食品安全监测等领域进行应用。

4 结论

采用环介导等温扩增技术对转基因水稻Bt63进行应用检测。该方法特异性好，并且灵敏度达到0.01%（W/W），具有简便、快速、准确等特点。

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（责任编辑 狄艳红）

Specific Detection of Genetically Modified Rice Bt63 Using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Zhang Mingzhe1Chen Xi1Xu Junfeng2Chen Wujian1Wu Rong3Wu Zhiyi1
（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine，Hangzhou 310016；2. Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021；3. Hangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 310012）

It focused on the specific detection of genetically modified rice Bt63 using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）. The LAMP could effectively detect genetically modified rice Bt63 with high specificity and the sensitivity limit is 0.01%（W/W）. LAMP is a rapid and accurate method and would be applied to inspection, quarantine and food safety.

Loop-mediated isothermal amplification Genetically modified rice Bt63 Detection

2013-09-06

国家质检总局科技计划项目（2011IK249），浙江省科技厅公益性项目（2011C22065），浙江省科 技厅重大专项（2011C12023），浙江出入境检验检疫局科研项目（ZK200958）

张明哲，男，高级农艺师，研究方向：分子生物学和植物检疫；E-mail：mzzhang429@163.com