实验室高效液相色谱仪的管理与使用维护

邹月利，徐雅琴，白靖文，赵李霞

(东北农业大学 理学院， 哈尔滨 150030)

随着科学技术的不断发展，高效液相色谱(HPLC)作为一种具有高灵敏度、高选择性和高效快速分离的检测技术得到了长足的发展，现已成为我国高等农业院校化学化工专业应用最广泛的分析方法［1］。它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，其应用范围已超过其他各种分离检测方法，尤其在生化医药样品的分析、分离方面更能充分发挥特长，目前广泛应用于食品安全、化学分析、环境科学、农药残留和石油化工等领域［2］。

高效液相色谱仪的科学管理和正确使用维护，是获得良好色谱分离效果和延长仪器使用寿命的前提和基础。化学实验中心于2012年12月对所有大型精密仪器设备实施网上预约共享管理模式，已经取得了良好的运行效果。虽然液相色谱仪的种类繁多，但是它们的管理方法与使用维护是一致的。本文结合对该实验室Agilent 1100高效液相色谱仪十几年的管理和使用经验，较详细地介绍了高效液相色谱仪在日常管理和使用维护等方面的一些体会，希望与同行们共享［3－4］。

1 管理与维护

化学实验中心在液相色谱仪的管理上，要求所有用户在使用仪器前必须仔细阅读操作流程，按具体要求进行操作。本科生一律在指导教师的陪同下方可使用，不得单独操作。

1.1 流动相

1)所用流动相必须经0.45 μm微孔滤膜真空抽滤2～3次，然后用超声仪超声45～60 min后，方可作为流动相使用［5］。

2)甲醇、乙腈等有机溶剂必须为色谱纯，当用酸或者碱来调节流动相pH值时，范围一定不能超过2～7.5。水则必须为去离子水，使用期限不得超过2 d，逾期则要重新配制。

3)流动相瓶口不准用密封带封死，以保证内外压力相等。不要随便更换流动相接口，A瓶(棕色)固定为水，B瓶(白色)固定为甲醇或乙腈;流动相的流速不要超过3.0 mL/min。

4)流动相禁止使用氯仿、三氯(代)苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等;慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、丙酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。

5)当有缓冲盐做流动相时，缓冲溶液与有机溶剂互相转换前一定要用5 甲醇清洗泵，防止盐在有机相中结晶损坏泵中各组件。缓冲溶液的浓度不能高于0.5 mol/L，尽量不超过该色谱柱的pH范围。Cl－的浓度要小于0.1 mol/L(防止腐蚀流路)。高浓度的缓冲盐会缩短密封垫和活塞的使用寿命，长时间使用0.1 mol或更高浓度的缓冲液时，必须用10 异丙醇溶液从泵的背面冲洗掉所有可能存在的结晶，从而保护柱塞杆和密封垫。用后的异丙醇经0.45 μm(或0.22 μm)滤膜过滤后可反复使用 2 ～3 次［6－7］。

6)当泵的压力上限超过6 000 psi时，应及时检查和更换泵头过滤白头和保护柱芯。

1.2 排气泡

1)当拧松快速清洗阀时不宜拧得过松，一般拧松2圈左右即可，拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警。

2)使用快速清洗阀时，只能一个一个通道地排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，因为比例阀的快速切换易导致损坏。

1.3 自动进样器

建议用甲醇∶水=1∶1的溶液洗针，同时每天洗针前要检查一下洗针瓶中是否有洗液(50 甲醇)。

1.4 样品处理

测定的样品或标样在流动相中一定要易溶，否则进样后会结晶造成定量不准确或堵塞色谱柱。最好使用流动相溶解样品，样品和标准溶液在进样前必须用0.45 μm(或 0.22 μm)滤膜(有机膜或者水膜)过滤，除去微粒杂质;样品中一般不得含有盐类及强酸、强碱性等物质。可以使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质［8］。

1.5 色谱柱

使用自带色谱柱，则应把换下的色谱柱用堵头(无孔)及时密封。用完后需把实验室原来的色谱柱安装好。换柱必须在有流动相流出的情况下进行，以免空气进入色谱柱。仪器长时间不用，每个泵通道和整个流路一定要用甲醇冲洗后保存，以免结晶或造成污染［9］。

1.6 检测器

1)检测器的紫外或可见灯在长期打开的情况下，一定要保证有溶液流经检测池。若不需要做样，可设置一个较低的流速(如0.05 mL/min)或关闭灯的电源。

2)检测器的灯一般要在流通池有溶液连续流动几分钟后才打开，如果流动池中有气泡，则会提示漂移过大无法通过自检和校正。

3)检测器的氘灯或钨灯不要经常开关，每开关一次灯的寿命约损失30 h。若仪器经常使用，可几天开关灯一次。

4)清洗检测池时可以在不接柱子的情况下，用100 异丙醇冲洗整个流路。如果还不行，同法用10 或5 的稀硝酸冲洗，大约45～60 min，最后用水冲干净。

1.7 实验结束

1)实验完毕立即清理操作台面，打扫室内卫生，拖干净地面，关好门窗。

2)如实做好实验登记。若机器出现异常，请勿擅自拆开机器，应及时通知仪器管理人员。使用液相色谱仪需提前预约，每次使用不准超过3 d，如继续使用则应再次进行网上预约。

2 操作流程

2.1 开机步骤

1)打开计算机后自动弹开＜CAG Bootp server＞→菜单→通信成功。

2)打开色谱仪开关，进入在线工作站。(红色:未就绪)

3)预热30 min即可。(黄→未就绪，绿→已就绪，蓝→采集数据，红→报警)

4)设置泵。点击＜泵＞＜检测器＞开关，左键点击＜泵＞→＜Solvent bottles＞→＜Solvent Bottles Fillng:Instrument 1＞设置每瓶中实际液体量、最低液体量及瓶容量。

5)排气泡。若新换流动相或长时间没开机，应向左旋开排气阀，逐个流动相瓶排气泡，排气时应逐渐升高流速(1～2 mL/min)，再逐渐降低流速。(1)在对话框中点击相应瓶A、B、C、D图标→＜Set up Pump… ＞。(2)出现 ＜Set up Pump:Instrument 1＞→设置＜Flow＞流速为1.0和瓶B、C、D的百分比(例如:A为100、B为0、C为0、D为0)即排A内的空气){＜Pressure Limits＞(压力)0～200之间;＜Timetable＞(设置梯度洗脱)。}(3)改变流速为1.5→OK!(当没有气泡即洗脱完毕，向右旋关闭排气阀，最后将流速调至使用流速——大约1.0 mL/min。)依次排B、C、D的气泡。

6)编辑检测方法。(1)首先编辑方法前将排气阀门关闭，将流速逐渐降至1.0 mL/min。(2)点击＜Method＞→ ＜Edit Entire Method＞。(3)弹出对话框 ＜Edit Method:Instrument 1＞a方法信息;b参数设置(可设置流量、波长、溶剂配比);c数据分析、报告处理(一般不选);d运行时间表。(4)点击＜OK＞进入＜Method Comments＞，可输入实验名称，也可不选，在后面也会提示输入。

7)参数设定。点击＜OK＞进入参数设定(根据文献或实验方法设定)。(1)＜Control＞(流速):一般为1～2 mL/min。(2)＜Solvents＞(溶剂名称及配比)。(3)＜Presswre Limits＞(压力限)Max:300 bar(压力保护限，默认);Min:0bar。(4)＜Timetable＞(洗脱梯度)一般为:一种溶剂配比递增或递减。(5)点 Display选择显示方式。(6)点＜OK＞→＜VWD Signal:Instrument 1＞(检测器设置)对话框，＜Wavelength＞(波长)，＜Peakiwidth＞(检测器响应时间):默认为＞0.1 min(2 s)。(7)点击 ＜OK＞→ ＜Run Time Checklist:Instrument 1＞对话框，选中＜Data Aequistion＞和＜Standard Data Analysis＞。(8)点击 ＜OK＞(存储检测方法):点＜Save Method as＞进入对话框，可输入名称和注释，也可不输，然后点＜OK＞结束方法存储。

8)基线调节。(1)点击界面左下角“三箭头”显示＜Online Plot＞对话框，观察基线是否平稳(波动在0.05个单位之间)＜Adjust＞(复位)，＜Balance＞(强制使基线归零)。(2)点击＜Change…＞(调节):基线走速(x轴)、吸收单位(y轴)、图表显示曲线数量，点＜OK＞结束进样前设置。

9)样品信息。(1)点击＜Run Method＞(运行方法)→ ＜Simple Info… ＞ → ＜Sample info:instrument 1＞:＜Operator Name＞(操作者姓名)、＜Data File＞中选＜Manual File Name＞:(输入文件名)(必须每次输入新名，否则覆盖前一次测试结果)，Subdirectory:(文件存储名)，Simple Name:(样品名)，Simple Amount:(进样量)，点＜OK＞结束样品信息输入。

10)开始进样。进样量一般5～25 μL。(仪器配有自动进样器)。

11)停止采样。峰出完后按＜F8＞或者＜stop＞停止(也可在＜Run control＞下拉菜单中关闭)，自动出现图表。可直接打印，也可进行峰型优化后再打印。

12)峰优化。打开＜offline＞(离线)，点击＜File＞→＜Load signal＞调出文件(或者点击界面图标打开):(1)打开文件保存的所在位置。(2)点击＜Graphics＞→＜Signal Options…＞可以进行优化处理。(3)选择＜Autoscale＞可以进行自动谱图优化。(4)点击＜Interqration＞→＜Interqration Event…＞进行人为峰筛选。(5)设置峰高域和峰面积域进行峰的筛选。(6)退出峰优化。

13)打印报告:(1)点击＜Report＞→＜Specfy Report…＞进行打印格式和内容设置。(2)选择＜Printer＞为直接打印，选择＜Screen＞为显示到屏幕后再打印。选中＜File＞可选择文件存储格式(File Type)，一般为.TXT格式，其他项为打印内容可选项。(3)点击＜Report＞→＜Print Report＞打印报告［10］。

2.2 关机步骤

将手动进样器扳手扳上去，拔出进样器(自动进样器除外);停止检测器和泵，退出色谱工作站;关闭液相色谱仪电源，关闭计算机。

3 结束语

以上介绍了液相色谱仪的日常管理维护和操作流程。分析工作者在实际工作中要管理和使用好仪器，使用过程中必须对仪器进行认真观察和仔细分析。只有合理地使用、维护和保养好仪器，在出现异常时认真分析产生异常的原因，对可能出现故障的部位作出正确的判断和适当的处理，才能使液相色谱仪更好地为实验教学和科研提供服务［11－12］。

［1］于世林.高效液相色谱方法及应用［M］.北京:化学工业出版社，2001:1－4.

［2］朱良漪，孙亦梁，陈耕燕.分析仪器手册［M］.北京:化学工业出版社，2000:495－495.

［3］项晓慧，阮慧，李五一.高校大型仪器共享管理系统建设的探讨与实践［J］.实验技术与管理，2011，28(1):196－199.

［4］巩克民，林锐，季宏建.高效液相色谱的优化与维护［J］.分析仪器，2012(6):96－98.

［5］严劲，方炯，卢皖琴.高效液相色谱的管理和维护［J］.医疗装备，2010，23(4):74－76.

［6］高惠玲，何予，李晓林.平台式、协会式相结合构建精密仪器管理网络［J］.实验室研究与探索，2011，30(2):180－182.

［7］张燕婉，孟宪敏.HPLC使用中常见问题及对策［J］.中国医学装备，2006，3(4):31－33.

［8］吴少敏，张雅芝，殷博昊.高效液相色谱的使用与维护［J］.实验室科学，2011，14(3):183－186.

［9］蔡晓庆，金辉乐，杨培洁，等.大型仪器管理人员工作交接的实践与探讨［J］.现代科学仪器，2011(6):157－159.

［10］富玉，陈能武.高效液相色谱的原理及研究进展［J］.中国测试技术，2007，33(3):36－40.

［11］张燕婉，汪劭婷.液相色谱技术在定量分析中的应用［J］.实验技术与管理，2007，24(10):25－28.

［12］冀斌，高静，顾文斌，等.浅谈高等中医药院校大型仪器管理的实践与探索［J］.实验室研究与探索，2011，30(8):402－404.