基于双向电泳－MALDI质谱分析的蛋白组学本科教学实验

岑卫健，朱平川

(广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004)

当前，基因组学已经从结构基因组学发展到功能基因组学，而蛋白质组学又是功能基因组学最尖端的领域［1］。蛋白质组学已成为研究生物学过程及直接描述细胞和组织变化的有力手段。特别在医药学领域，蛋白质组学是寻找人类疾病的新生物标志物和发现药物治疗新靶点的一种主要工具［2］。双向电泳结合生物质谱技术是蛋白质组学研究中的最常用的蛋白质分离和鉴定技术之一［3］，是目前广泛应用、经典的蛋白质组学研究途径［4］。但这项实验难度较大，对实验员的实验技能有较高的要求［5］，而且实验药品昂贵，影响实验结果的因素很多。据了解，国内的院校在相关专业本科实验教学中开设“双向电泳－MALDI质谱分析”实验的寥寥无几。但考虑到现代生物科学发展的需要以及专业的特点，我们改变了传统的教学模式，以“双向电泳－MALDI质谱分析”实验为试点，充分利用亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的大型仪器，积极进行教学模式的改革。学校特批了一笔大型仪器共享平台的开放资金用于生物技术专业的学生开展“双向电泳－MALDI质谱分析”实验，总学时为30个。

1 传统的实验模式存在的问题

广西大学生命科学与技术学院在生物技术和生物工程两个专业的本科生中开设有生化技术实验课，其中有关蛋白组学方面的实验内容包括考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质溶液的凝胶层析脱盐等。以SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定实验为例，实验流程如下:SDS－聚丙烯酰胺凝胶、加蛋白样品、电泳、染色、脱色。由于受实验条件的限制，此实验仅仅做到了一维的凝胶电泳，实验内容单一，教学目标也仅仅是让学生认识到蛋白电泳最基础的步骤而已。学生无法做到理论联系实践，实验过程处于被动状态，做完实验后也只是懂得课本上的理论而已。

2 基于双向电泳－MALDI质谱分析的蛋白组学实验

在传统观念中，大型仪器价值较大，维护及维修费用昂贵。如在本科教学中使用大型仪器出现损坏，则会影响科研工作的进展，所以大型仪器基本上只用于科研工作中。为了求证大型仪器应用于本科教学的可行性，我们尝试在本科3年级生物技术专业的学生中开展基于双向电泳－MALDI质谱分析的蛋白组学实验。这部分学生已完成了《有机化学》《分析化学》《分子生物学》和《生物化学》等理论课和基础实验课，掌握了一定的理论知识和实验技能，具备了一定的科研实力。为了更好激发学生的学习兴趣，我们将实验设计成三个阶段。

2.1 理论知识巩固阶段

在实验的前两周，要求学生4～5名为1组，通过阅读文献，观看双向电泳－MALDI质谱分析实验视频，老师讲解，通读实验手册，以野油菜黄单胞菌为材料制定实验方案。

2.2 双向电泳阶段

实验设施依托亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的大型仪器开放平台。实验室全天开放，学生不局限于某一时间段进行实验。实验基本流程如下:

第一向等电聚焦。在蛋白上样液中加入5(v/v)IPG缓冲液。每根24 cm PH3－10 IPG胶条蛋白上样量为350 μg。等电聚焦条件:20℃;30 V，6 h;60 V，6 h;500 V，1 h;1 000 V，1 h;1 h Gradient 1 000～8 000 V;8 000 V，80 000 vhr。

平衡。等电聚焦后的胶条在15 mL平衡液Ⅰ［0.05 mol/L Tris－cL pH8.8，6 mol/L尿素，30(v/v)甘油，10 g/L DTT，2 (w/v)SDS，0.002(w/v)溴酚蓝］中平衡15 min，再在15 mL平衡液Ⅱ(将10 g/L DTT换成40 g/L碘已酰胺，其余组分均同平衡液Ⅰ)中平衡15 min。

第二向SDS－PAGE。将平衡好的IPG胶条转移到SDS－PAGE凝胶上，用封闭液(0.192 mol/L甘氨酸，0.025 mol/L Tris Base，0.1 (w/v)SDS，0.5 低熔点琼脂糖)封顶，连接Ettan DALT twelve系统，进行第二向SDS－PAGE。凝胶先用10 mA/块凝胶恒流进样，再改为30 mA/块凝胶恒流直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部。

硝酸银染色具体步骤如下:固定(200 mL甲醇，50 mL冰乙酸，250 mL超纯水)30 min;敏化(150 mL甲醇，34 g无水乙酸钠，1.0 g硫代硫酸钠，加超纯水至500 mL)30 min;漂洗 3次，5 min/次;银染(1.25 g硝酸银加超纯水至500 mL)20 min;漂洗 20 min，1 min/次;显色(200 μL甲醛，12.5 g碳酸钠，加超纯水至500 mL)4～10 min;终止(12 冰乙酸)2 min。

凝胶图像分析。GE公司的Image Scanner扫描仪对凝胶扫描，用ImageMaster2－DE Platinum 5.0软件对图像进行后续分析。

2.3 质谱分析阶段

双向电泳实验完成后，每组学生随机从凝胶上5～10个蛋白点做质谱分析。在质谱上样前，要先将蛋白质酶解成肽段，然后点靶，质谱进样鉴定蛋白。酶解是质谱分析是否成功的关键因素，所有的试剂药现配现用，具体步骤如下:

1)脱色。每管加入现配脱色液50～80 μL(视胶粒大小而定)，静置2 min;当胶粒由棕黑色变成亮黄色(与脱色液颜色相同)，迅速加入400 μL Milli－Q水终止反应;吸出液体后重新加入400 μL Milli－Q水振荡洗涤，再吸出液体。

2)洗涤。每管加入 200μL 40mmol/L NH4HCO3，振荡洗涤2 min，吸出液体，重复一次。

3)脱水。每管加入100～150 μL ACN，振荡脱水;待胶粒变白，吸出ACN，于真空干燥箱或真空浓缩仪干燥10 min。

4)酶解。根据胶粒大小，加入合适体积的胰蛋白酶工作液(以完全覆盖胶粒为准)，冰浴45 min，使胶粒充分吸收酶液并溶胀。然后，吸出多余酶液，加入20～40 μL覆盖液(以完全覆盖胶粒为准)，倒置放于37℃烘箱中孵育过夜(12～16 h)。

5)肽段萃取。将酶解过夜的EP管取出，吸出酶解溶液于另一干净1.5 mL EP管内，在装胶粒的EP管中加入萃取液20 μL，振荡洗涤20 min，吸取液体与第一次吸取的液体合并，再往胶粒中加入萃取液20 μL，振荡洗涤10 min，并超声5 min，吸取液体与前两次的合并。

6)真空干燥。将离心的肽段萃取液于真空干燥机内浓缩抽干，加入1 μL 0.1 TFA水溶液复溶，置于－20℃环境中保存待用。

2.4 实验总结

双向电泳－MALDI质谱分析实验是一个综合性实验，涉及的实验内容比较多，实验步骤繁琐，对实验人员的实验操作技巧要求比较高。本次实验共有6组学生，总人数为30名。其中有1组学生得到了非常好的双向电泳图谱;3组学生通过质谱的鉴定均鉴定得到6～10个蛋白;1组学生实验失败。每组学生实验结束后均要写一篇实验总结报告，总结实验失败的原因，下次应该如何改进。通过这个实验，学生对蛋白质组学有了全面的了解，可以将课本上的理论知识与实验联系，这是新时代生物技术专业毕业生应具备的素质。

3 开放大型仪器培养技术型人才

本次实验探索在老师和学生当中得到了肯定和好评，我们决定加大力度，借助亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的大型仪器共享平台，让大型仪器全面支撑本科教学实验，为我院学生毕业以后顺利融入社会打下基础。我们主要通过以下举措来支撑本科实验教学，提高学生的综合素质:(1)定期举办大型仪器理论、操作培训班，由有经验的、熟悉大型仪器的管理人员任教，请仪器公司的工程师举办仪器专题讲座，帮助学生解决实验难题。(2)开设一门以大型仪器为主的课程——《大型仪器分析》作为选修课程，专门针对大型仪器的操作使用感兴趣的学生。(3)将大型仪器融入到本科实验中。考虑到现有大型仪器的情况及课程的衔接等因素，实验老师对所有的本科实验教材作了修改并进行了可行性分析。我们以生物技术专业作为试点，将蛋白组学研究相关实验全面贯穿于本科实验，涉及的大型仪器有液相色谱仪、蛋白纯化仪、质谱仪、液质联用仪、双向电泳系统、酶解仪等，主要的实验内容是分别从两条路径去鉴定蛋白质，双向电泳－质谱和液相色谱－质谱，让学生将理论与实践相结合。由于大型仪器支撑的实验过程复杂，实验时间较长，对实验人员的要求比较高，所以该部分实验作为选修课程，学生可根据自己的兴趣爱好来选择。(4)大型仪器共享平台向学生全天开放，让感兴趣的学生融入到科学研究中，使学生有更多的机会接触大型仪器，提高实验操作能力。

通过以上措施，让广大师生对国家重点实验室的大型仪器有了充分的了解和认识，使他们的实验操作技能有了大幅度的提高，从而提高学生的素质，提升实验教学质量。

4 结束语

本科教学实验的创新改革证明大型精密仪器设备资源完全可以用于支撑本科教学实验。以大型仪器作为支撑，改变本科实验设备简陋问题，将本科教学中简单的验证性实验变为综合性、研究性实验，给予足够空间让学生琢磨、摸索、相互讨论、学习。本科学生在校期间借助大型仪器完成各类综合实验，对于提高实验技能、开拓专业视野及培养创新思维具有重要意义。同时，大型仪器应用于本科实验教学也大大提高了仪器的使用率，在不与科研工作使用仪器冲突的情况下，合理安排时间，可以逐渐在本科实验教学中加大大型仪器的使用频率。

在实践中我们也应该注意如下两个事项:(1)综合性实验比单纯的验证性实验要复杂，实验方案、实验人员的技术水平都会直接影响到实验结果，相同的实验，学生得到的实验结果有时会相差很大。这就要求学生做实验总结，把握实验的关键点，动脑筋，勤思考，只有这样才能从实践中掌握实验技术。(2)仪器昂贵，维护和维修成本比较高，综合性实验时间较长，还会使用到许多有毒试剂、药品，要求老师要有较强的责任心，实验过程中要全程跟踪学生实验，避免发生事故，损坏仪器。

总之，我们将不断探索和实践，在本科教学中利用国家重点实验室的大型仪器来提高实验教学质量，培养更多技术型人才。

［1］陈执中.蛋白组学研究的新分析技术及其应用［M］.北京:中国医药科技出版社，2011.

［2］Omenn G S.Strategies for plasma ptotemic profiling of cancers［J］.Proteomics，2006(6):5662 －5673.

［3］胡志远，贺福初.蛋白质组研究进展［J］.生物化学与生物物理进展，1999，26(3):202－205.

［4］魏开华，应天翼.蛋白质组学实验技术精编［M］.北京:化学工业出版社，2010.

［5］谢青，吴元喜，刘笔峰，等.蛋白质双向电泳实验课的建设与实践［J］.实验科学与技术，2009，7(6):99－101.