受体报告基因实验及其在维甲酸和维甲酸X受体干扰物监测中的应用

钟恩惠，王艺磊，王淑红

集美大学水产学院，厦门 361021

受体报告基因实验及其在维甲酸和维甲酸X受体干扰物监测中的应用

钟恩惠，王艺磊，王淑红*

集美大学水产学院，厦门 361021

受体报告基因实验具有快速、经济、灵敏、方便等诸多优势，在高通量筛选类或抗雌雄激素等通过核受体起作用的环境内分泌干扰物方面得到了广泛的应用。环境中的维甲酸和维甲酸X受体干扰物如有机锡等有着类似的作用机制，研究者也开始采用受体报告基因实验的方法对该类污染物进行筛选与监测。本文综述了受体报告基因实验的技术方法，包括报告基因和宿主细胞的选择，并介绍了该方法在人工合成的维甲酸和维甲酸X受体干扰物筛选以及环境样品中该类污染监测中的应用。综述总结了应用受体报告基因实验检测环境内分泌干扰物研究中的不足并对该方法的未来发展进行了展望，希望为该方法在环境监测和评估中的应用提供新的思路。

受体报告基因实验；维甲酸受体(RAR)；维甲酸X受体(RXR)

环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指可改变生物或其后代、或(亚)群体内分泌系统功能，进而引起不良健康效应的外源化合物[1]。此类污染物涉及的化合物种类繁多，对生态健康的影响很大，因此，该类污染物的筛选与监测一直以来都是环境科学领域的重点与难点。受体介导是EDCs干扰生物内分泌系统的主要作用机制。研究表明，EDCs具有类似于内源性激素的化学结构，与受体有一定的亲和力，可通过与受体结合而对生物产生类或抗激素的干扰作用。

核受体作为配体依赖型的转录因子，是很多类固醇激素或小分子物质发挥生理作用的媒介。能够与该类受体结合的化合物可采用受体报告基因实验(receptor reporter gene assay)的方法进行体外筛选。该方法既能检测外源性化合物与受体的结合能力，还能区分激动剂和拮抗剂。相对于体内实验，体外筛选具有快速、经济、方便等优势，在类或抗雌雄激素EDCs的筛选中发展迅速并且得到了广泛的应用。研究者对大量化合物的类或抗雌雄激素效应进行了筛选，也对水体[2-3]、食物添加剂[4]、包装容器[5]等各种环境样品中该类EDCs的存在进行了监测。

在对类/抗雌雄激素EDCs研究越来越深入的同时，研究者也将目光扩展到能够与其他核受体结合的环境污染物，如类或抗甲状腺激素[6-7]和维甲酸及维甲酸X受体干扰物[8-9]。很多动物实验和体外实验的证据显示，维甲酸和维甲酸X受体信号通路极易受到环境化合物的影响，其中最典型的案例是有机锡，如三丁基锡(tributyltin, TBT)和三苯基锡(triphenyltin, TPT)对海洋腹足类的影响。海水中极低浓度的有机锡可诱导雌性前鳃亚纲腹足类出现雄性特征(如阴茎和输精管)，发生性畸变，严重时会导致繁殖失败，甚至种群消亡[10-11]。新近的研究表明，有机锡可能是通过与腹足类动物的维甲酸X受体(retiniod X receptor, RXR)结合而诱导性畸变的[12]。同时，有机锡化合物在人类[13]、鱼类[14-15]和甲壳类[16]中都能作为配体而激活RXR的转录，产生脂类代谢紊乱[17]、免疫失调[18]、睾酮代谢紊乱[19]等非常严重的生物学效应。环境维甲酸和维甲酸X受体干扰物作为一种危害严重的核受体干扰物尚未引起人们的足够重视。因此，本文就受体报告基因实验方法以及该方法在环境维甲酸和维甲酸X受体干扰物监测中的应用进行综述和展望，希望为该类化合物的筛选和环境样品中该类污染物的监测和风险评估提供参考。

1 受体报告基因实验

1.1 受体报告基因实验的构建方法

受体报告基因实验方法的技术基础是核受体介导的信号转导机制。首先需要克隆获得相应受体的编码区或功能结构域的序列，并构建该受体的超表达质粒。同时需要合成核受体与靶基因调控区结合的反应元件(response element, RE)，采用基因重组技术将RE序列连接到报告基因的调控区，构建重组报告基因载体。应用细胞转染技术将含核受体编码区的超表达载体以及含核受体反应原件的报告基因载体导入宿主细胞(酵母或哺乳动物细胞)，建立相应的转录激活系统。当系统中存在能够与核受体结合的配体即外源性化合物时，核受体将被激活，然后与报告基因启动子区域的RE结合后，启动报告基因的表达。最后，通过检测报告基因编码的酶活性或蛋白表达量的变化，间接反映内源性靶基因的表达情况。

这种方法不仅能够检测化合物与受体的结合能力，还可以检测结合后引起的生物学效应，而且能够区分激动剂和拮抗剂，因此成为评价和筛选核受体干扰物的有力工具。受体报告基因实验技术主要涉及报告基因和宿主细胞的选择。

1.2 报告基因的选择

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，通常是表达产物非常容易被鉴定的基因。目前受体报告基因实验常用的报告基因主要有氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyl transferase, CAT)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-Gal)和荧光素酶(luciferase, Luc)基因4种。

CAT基因来源于大肠杆菌转位子9，该酶在细菌中可以使氯霉素失效并使细菌对氯霉素产生抗药性。CAT可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素，阻止氯霉素与核糖体结合而使氯霉素失效[20]，可通过同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定乙酰基化的氯霉素的量而量化CAT的活性。CAT在哺乳动物细胞无内源性表达，且性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。徐莉春[21]以CAT为报告基因建立的受体报告基因实验对化学物质的类/抗雄激素进行筛选，成功筛选了一批雄激素受体的激动剂和抑制剂。虽然CAT具有在真核细胞本底低、分析时信噪比较高和重复性好的优势[22]，但由于该检测方法比较繁琐，与其他报告基因相比线性范围较窄且灵敏性较低，因此其应用受到一定的限制。

荧光蛋白家族是在水螅纲和珊瑚类动物中发现的同源性蛋白，相对分子质量在20到30 kD之间，包括红色、黄色、绿色和青色荧光蛋白等。其中，GFP是应用最多的一种。GFP基因在细胞中的表达后无需裂解细胞，也不用额外添加酶底物，直接利用荧光显微镜或荧光分光光度计就可进行定量检测。此外，GFP还具有对热、极端pH和化学变性剂稳定的优势。Xu等[23]构建了双细胞系绿色荧光蛋白表达系统来鉴定和研究具有雌激素受体激动剂和抑制剂活性的EDCs。由于GFP自身具有发荧光的特性，多用于在体内报告基因的研究，如中国的香港城市大学[24]和日本的[25]研究者利用转基因青鳉监测类雌激素的化合物。

β-Gal是大肠杆菌乳糖操纵子中lacZ基因编码的产物，能催化各种半乳糖苷的水解。该报告基因最大的优势在于分析方法简单，常规的分光光度计即可完成分析测定，且灵敏度随不同底物而不同。利用重组酵母所建立的受体报告基因检测方法大多选择β-Gal作为报告基因。

Luc可以催化荧光素氧化，在氧化过程中，会发出生物荧光，最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和海肾(renilla)荧光素酶。与其他报告基因相比，荧光素酶报告基因有许多优点。首先，哺乳动物细胞无内源性荧光素酶，不用担心内源性信号的污染。其次，该报告基因检测方法简单、易操作、非放射性。可采用化学发光微孔板检测仪快速灵敏地测定荧光素酶基因的表达，非常适用于高通量筛选。此外，该方法的灵敏度很高，荧光素酶浓度在10-16到10-8mol·L-1范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到10-20mol·L-1的荧光素酶[26]。值得指出的是，荧光素酶在哺乳动物细胞中的半衰期为仅为3 h[27]，在细胞中不会积累。上述优点使得Luc成为最常用于哺乳动物细胞的报告基因，各大生物试剂公司相继开发了多种Luc商品载体，为报告基因的研究提供了极大的方便。

在以上4种报告基因中，以β-Gal作为报告基因的酵母检测最为便捷，但由于β-Gal在哺乳动物细胞中有内源性活性，需要较高的pH值削减其活性，在哺乳动物细胞中不常使用[28]。CAT和Luc是哺乳动物细胞常用的报告基因，尤其是Luc，因上述诸多优点而被广泛采用。但这些报告酶基因的检测需要裂解细胞并添加酶底物，不适用于完整细胞的检测，如微流控细胞分析。GFP作为自发荧光的一种蛋白检测时不需破坏细胞，可用于连续检测。但由于GFP缺乏酶促扩大效应，其灵敏性比Luc低，较少应用在体外受体报告基因实验中。

此外，在以哺乳动物细胞为基础的报告基因实验系统中，为了减少转染效率等系统误差。常采用双报告基因的实验方法。即在使用萤火虫荧光素酶的同时结合CAT、β-Gal或葡萄醛酸苷酶(GUS)等报告基因作为辅助参照。但由于这些辅助报告基因各自的检测化学手段、操作要求和测量特点有很多不同而不够便利。最近，一些生物公司开发了双荧光素酶报告基因技术，将萤火虫荧光素酶检测和海肾荧光素酶检测相结合，可以在单反应体系中进行双荧光素酶报告基因的检测，更加快速、灵敏、简便，得到越来越多研究学者的青睐。Oka等[29]采用双荧光素酶报告基因的方法检测了化学物质对3种蛙、1种鱼、1种鳄鱼以及人类甲状腺激素受体的激动或抑制作用，获得了更为可靠的核受体报告基因实验的结果。

1.3 宿主细胞的选择

受体报告基因实验常用的宿主细胞有酵母细胞[9,30]、哺乳动物细胞[28]和核受体同源动物细胞[31]。酵母是单细胞低等真核生物，以此建立的重组酵母检测系统具有遗传背景清楚，无内源性激素影响，表达产物与天然蛋白生物活性相似等特点，此外，实验还具有灵敏度高，操作方便，经济，周期短等优点[32]。因此，重组酵母检测系统是最常用的EDCs高通量初筛的方法。但是，酵母细胞缺乏类似哺乳动物细胞的代谢能力，对于一些需要经过体内羟化、磺化或甲基化等过程被代谢活化或灭活的EDCs在酵母检测系统中有可能会出现假阴性或假阳性的结果。而且酵母细胞的细胞壁比哺乳动物的细胞膜厚韧，通透性较差，可能影响某些化合物进入细胞的浓度，从而造成结果的偏差[33]。因此，哺乳动物细胞系也是受体报告基因实验常用的一类宿主细胞。用于受体报告基因实验的哺乳动物细胞系主要有MCF-7(人乳腺癌细胞)[34]、T47D(人乳腺管癌细胞)[35]、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)[36]和HEK293(人胚肾细胞)[37]、COS(非洲绿猴肾细胞)[38]等。相比重组酵母系统，哺乳动物细胞能指导蛋白质正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因此其表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近天然的高等生物蛋白质分子。

值得指出的是，尽管化学性配体对核受体的转录激活机制相当保守，但许多细胞内的因素(如启动子环境、细胞环境或受体的物种来源)会对转录激活实验的结果产生影响。有研究表明，雌激素受体介导的基因转录依赖辅活化因子的补充，且这些辅活化因子存在细胞或组织差异[39-40]。Xu等[23]以GFP为报告基因研究化学物质对雌激素受体的激动或抑制效应时也发现，三苯氧胺和雷洛昔芬对人乳腺癌细胞MCF-7和子宫内膜癌石川细胞的效应有显著不同，显示出明显的组织差异。因此仅采用基因工程酵母细胞或哺乳动物细胞系研究化合物对不同动物核受体受体信号通路的影响是不全面的。全面而准确信息的获得需要采用核受体同源的细胞系，构建类似于在体状态细胞环境的受体报告基因检测系统。目前这方面的工作只见于类雌激素污染物的研究。Cosnefroy等[31]在斑马鱼肝细胞系中稳定转染了报告基因载体ERE-βGlob-Luc-Svhygro和斑马鱼雌激素受体ERα、ERβ1和ERβ2表达载体，构建了稳定的报告基因检测系统以评估化学物质对水生脊椎动物的危害。

在实际的研究工作中，研究者应根据具体的研究目的选择宿主细胞。在进行核受体干扰物筛选的实验中，可选择酵母或哺乳动物基因工程细胞，有利于标准化实验操作程序，进行高通量筛选。如果研究的目的是评估某种化合物对具体某一物种或一类物种的生物学效应时，则应选取与该核受体同源的动物细胞。

2 受体报告基因实验在维甲酸和维甲酸X受体干扰物污染监测中的应用

维甲酸(retinoic acids, RAs)也称为视黄酸，有全反式RA(all-trans RA, atRA)和9-顺RA(9-cis RA, 9cRA)2种主要的同分异构体，是维生素A(vitamin A)的氧化代谢产物[9,41]。RAs及其代谢产物在动物的胚胎发育、器官形成、生殖等都发挥重要作用，过量或缺乏将导致胚胎畸形发育。在动物体内RAs作为配体，可与RARs和RXRs结合，作为转录因子与靶基因启动子区域的特定反应元件结合，启动特定基因的转录而传递生物学信息[42]。其中atRA只与RARs结合，而9cRA能与RARs和RXRs两种受体结合[43]。许多外源性化合物通过模拟或抑制生物体内的天然维甲酸，从而干扰维甲酸的信号通路，对生物机体产生影响。对这类污染物的监测可通过检测RARs和RXRs核受体的转录活性而追踪污染物的存在。

2.1 RARs和RXRs激动剂/抑制剂的筛选

许多内源性化合物和异生物质通过模拟/抑制天然维甲酸与维甲类受体(即RAR或RXR)结合，从而干扰生物体正常的维甲酸信号通路。近年来，国内外研究学者采用受体报告基因实验成功筛选了维甲类受体—RAR和RXR的激动剂和抑制剂。

Lemaire等[38]在Hela细胞转染了表达荧光素酶的报告基因载体以及含RARs基因的表达载体，检测有机氯农药艾氏剂、氯丹、狄氏剂、异狄氏剂和硫丹对人的RARα、RARβ以及RARγ的激动和抑制作用，发现这些化合物都能微弱地激活RARβ和RARγ，但不能激活RARα。其中，异狄氏剂激活作用最显著，对RARβ和RARγ的50%有效浓度分别是17.6和6.0 μmol·L-1。Kamata等[9]在酵母细胞中转染了含人RARγ的诱饵质粒和共激活因子TIF2的靶质粒，对543种化合物(包括工业化学品、农药、天然化合物、药物和化妆品)进行评估，结果显示有85种化学物质，其中有16种有机氯农药，14种苯乙烯聚合物，9种烷基酚以及6种对羟苯甲酸酯检测出具有RARγ激动剂作用。尤其是烷基酚与RARγ有高亲和力，相当于全反式RA的0.446～1.363%。Li等[30]将表达质粒pGBT9 hRXRβ(含GAL4 DNA结合域和hRXRβ配体结合域)以及报告基因质粒pGAD424 GRIP1/FL(含GAL4 DNA激活域和GRIP1/FL全长)转化至酵母中，检测了16种化学物质与RXR的结合活性。其中有10种化学物质被检测出具有RXR激动活性，15种显示出抑制活性。最近，Kabiersch等[44]利用雌激素受体反应元件(estrogen receptor responsive elements, ERE)和萤火虫荧光素酶报告基因构建了BMAEREluc酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)报告菌株，并在表达载体中嵌合人RXRα的配体结合域以及人ERα的DNA结合域，以此构建了生物发光酵母实验(bioluminescent yeast assay)。该作者通过这一检测系统证实有机锡化合物和RXR的天然配体全反式维甲酸(all-trans RA, atRA)以及9-顺RA(9-cis RA, 9cRA)与RXR具有高特异性。该检测系统可以在纳摩尔级浓度检测TBT和TPT(分别是30和110 nmol·L-1)，并进行小规模高通量分析。

Kamata等[9]和Kanayama等[45]的研究表明相比维甲类受体(RARs和RXRs)的天然配体atRA或9-cRA，绝大多数异生性化合物对RARs/RXRs的激动/抑制作用是非常小的。因此，这些污染物质在正常的环境浓度内干扰大多数生物的RARs/RXRs的信号通路的可能性较低，不致对生物造成不利影响。但是，一些异生性化合物如有机氯农药性质极为稳定，能够在生物组织中积累，通过食物链产生生物放大作用。所以尽管它们的RARs/RXRs激动/抑制作用微弱，但如果在胚胎发育期间暴露在这样相对较高的异生性物质环境当中，同样可能对生物造成不利影响[46]。而且，有些维甲酸和维甲酸X受体干扰物的毒性效应不容忽视，如有机锡化合物在纳克级浓度水平[47-48]就可导致腹足类产生性畸变，也是哺乳动物潜在的肥胖激素[49]，同时对鱼类和两栖类具有较强的致畸效应。Fent等[50]研究TPT对鱥鱼(Phoxinus phoxinus)不同早期发育阶段的影响结果显示，TPT的暴露会导致其幼体骨骼畸形(弯尾)，运动能力降低。Shi等[51]研究TBT对两栖类热带爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎的影响时发现，TBT的浓度在12.5～200 ng·L-1(4.6～73 ng Sn·L-1)(接近环境相关浓度)时会抑制热带爪蟾的变态，干扰性腺的分化。介于这些化学物质的不利影响，需要我们对其在环境样品中的污染情况进行跟踪监测。

2.2 环境样品中维甲酸和维甲酸X受体干扰物的监测

受体报告基因实验不仅应用在RARs和RXRs激动剂和抑制剂的筛选，越来越多的学者也将这种方法用以监测环境样品中维甲酸和维甲酸X受体干扰物的污染。

Gardiner等[52]最先在天然的水环境中发现RAR激动活性。他们在美国2条河流中发现RARα激动活性的存在，认为这些RAR激动剂的存在也可能是导致这些流域频繁出现畸形蛙的原因。Inoue等[53]从日本4条河流中采集16个水样，采用酵母双杂交的方法检测其对人的5种核受体，包括雌激素受体(estrogen receptor α, ERα)、甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor α, TRα)、RARα、RXRα和维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)的激动活性。结果发现有8、15、6、6和9个样品分别对ERα、RARα、TRα、RXRα和VDR这5种核受体具有显著的激动活性(P<0.05)，表明河流已被核受体干扰物污染，并发现RAR激动剂污染比ER激动剂污染更严重。随后，他们又在日本2条河流中分别设20个站位，在不同季节采集水样，采用同样的方法来研究河流中RAR激动剂的时空变化并调查河流中潜在的RARα激动剂污染来源。他们发现这2条河流中存在2种高活性的未知RARα激动剂，既不是RAs也不是4-oxo-RAs，而是2种未知的化合物。并且RARα激动剂污染物的空间变化模式与ERα激动剂污染物的完全不同。众所周知，污水处理厂是ERα激动剂污染物的主要来源，因此作者提出污水处理厂的排出水不是RARα激动剂的主要来源[54]。接着，他们同样采用酵母双杂交的方法，又检测了日本7家污水处理厂中处理的和未处理的水样对4种核受体(雌激素受体α、甲状腺激素受体α、维甲酸受体α和维甲酸X受体α)的激动活性，在所有水样中都被检测出对以上4种核受体有激动活性。而后他们对通过不同的生物处理工艺的污水进行检测，发现激动活性有减小，但并没有完全去除[55]。Zhen等[56]也利用酵母双杂交技术对北京7家污水处理厂及其接收河流样品中的RAR激动活性进行检测，并对水样通过高效液相色谱分离后用质谱分析，确定RAR激动剂是全反式4-氧代-RA(all-trans-4-oxo-RA)和13-顺式-4-氧代-RA(13-cis-4-oxo-RA)这2种化学物质。李剑等[57]将含有RXR基因的酵母表达质粒pGBT9-RXRβ和含有GRIP1基因的酵母表达质粒pGAD424-GRIP1共转染至酵母细胞Y187而构建酵母双杂交系统，筛选对维甲酸X受体产生干扰的化合物，并对水厂进出水样的维甲酸X受体干扰效应进行检测。发现三丁基锡乙酸盐是激动剂，而Aroclor1254(多氯联苯混合物)是拮抗剂；水厂进水样品抑制9cRA诱导的酶活性，说明进水样品中含有RXR拮抗剂；但出水样品并没有检测出对9cRA诱导酶活性的抑制效应，说明该厂的现行处理工艺可以较好地去除水中RXR拮抗剂。随后，他们应用已构建的RXR-GRIP1双杂交酵母检测系统筛选南方某污水处理厂不同工艺出水的维甲酸干扰活性，并结合大鼠肝均浆(S9)体外代谢方法检测样品的间接维甲酸干扰活性。结果表明在城市污水中存在大量具有类/抗维甲类干扰活性的化合物[58]。Jiang等[8]在中国的6条主要河流以及3家饮用水处理厂采取水样，通过酵母双杂交技术检测其RXR激动活性或抑制活性。结果在所有的样品中都可以显著观察到RXR的拮抗活性却没有发现RXR激动活性。

从Gardiner[52]发现水域中存在维甲酸干扰物污染开始，越来越多的学者通过不同的体外检测方法，对天然河流流域以及饮用水源和排出的污水，甚至沉积物和空气样品[59-60]进行监测，都检测到RARs或RXRs的激动或抑制活性，这说明维甲酸和维甲酸X受体干扰物在环境样品中是广泛存在的。但到目前为止，只有Zhen等[56]鉴定出7家污水处理厂及其接收河流中RAR激动剂污染物是全反式4-氧代-RA和13-顺式-4-氧代-RA。有机锡造成腹足类性畸变的严重后果提醒我们，维甲酸和维甲酸X受体干扰物的危害，尤其是对某些敏感物种的危害是相当严重的，非常有必要深入广泛的进行维甲酸和维甲酸X受体干扰物的调查研究，以更好地了解环境样品中维甲酸和维甲酸X受体干扰物的污染情况，鉴定并跟踪这类污染物在环境样品中的状态和归宿，以详实丰富的信息切实评估其可能存在的生态风险。

3 受体报告基因实验在维甲酸和维甲酸X受体干扰物作用机制研究中的应用

受体报告基因实验，不仅是高通量的筛选RARs和RXRs的激动剂和抑制剂以及跟踪检测环境样品中维甲酸和维甲酸X受体干扰物污染的有效工具，还可用于研究这类干扰物的作用机制。有机锡致腹足类性畸变的分子机制一直以来众说纷纭，没有定论。腹足类RXR基因的克隆与功能研究表明，性畸变与RXR信号通路密切相关，其中报告基因实验功不可没。

Urushitani等[61]采用荧光素酶报告基因在cos-1细胞的转录激活系统中研究了机锡化合物与疣荔枝螺(Thais clavigera)2种亚型的RXR，包括TcRXR-1和TcRXR-2的结合情况，探讨了有机锡化合物诱导腹足类性畸变的分子机制。他们的研究显示9cRA以及有机锡化合物三丁基氯化锡和三苯基氯化锡分别在浓度为10-8、10-8和10-7mol·L-1时能显著提高TcRXR-1的转录活性，并发现TcRXR-2和TcRXR-1对9cRA的反应存在差异，推测二者可能具有不同的分工。最近，该课题组再次利用报告基因实验(包括哺乳动物细胞单杂交实验和双杂交实验)研究atRA对疣荔枝螺维甲酸受体(TcRAR)类似蛋白转录活性的影响，并未观察到该蛋白的配体依赖型转录活性，只有在TcRAR和TcRXR同时存在时才能检测到转录活性，表明TcRAR不能被维甲酸和维甲酸受体干扰物激活，但是能与TcRXR形成异源二聚体[62]，即该类污染物很可能是通过与TcRXR结合，TcRXR与TcRAR形成异源二聚体。

4 总结与展望

综上所述，受体报告基因实验检测水环境中维甲酸和维甲酸X受体干扰物具有快速、灵敏的优势，可为检测污染物潜在的内分泌干扰毒性以及初筛释放到环境中的化学物质的安全性提供有效工具。目前被广泛应用于筛选类雌激素、类雄激素等内分泌干扰物的报告基因实验法在维甲酸和维甲酸X受体干扰物的监测和筛选方面，尚处于起步阶段，对环境样品中维甲酸和维甲酸X受体干扰物的检测研究也非常有限，有必要扩大筛选范围和研究水域，丰富该类化合物的相关背景分布的信息。

值得指出的是，大多数核受体报告基因的体外检测系统都是以人类或鼠等哺乳动物源的核受体为研究对象，但人类的研究结果并不能够简单的适用于野生动物。研究表明，尽管人和黑头软口鲦(Pimephales promelas)AR的配体结构域相似性很高，EDCs的亲和性仍在哺乳动物和鱼类有所不同，表明同样的EDCs对不同物种的影响极可能不同[63-64]。同样的差异在比较增塑剂与ER的亲和性研究中也被发现[65]。Katsu等[66]研究发现4种两栖动物的雌激素受体对天然雌激素以及环境化学物质灵敏性存在物种差异。Oka等[29]以3种蛙、1种鱼、1种鳄鱼以及人类的甲状腺激素受体建立瞬时转录激活检测系统来筛选潜在具有甲状腺激素受体活性和抗甲状腺激素受体活性的化学物质，发现10-5mol·L-1四溴双酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)会抑制T3激活青鳉TRα的转录能力，然而在其他物种中并没有发现。李维等[67]比较不同物种RXR的配体结构域的氨基酸序列，发现软体动物和人类RXR相似度很高(>93%)，但和果蝇RXR同系物超气门蛋白(ultraspiracle, UPS)的相似性仅为44%，这表明其配体会有很大的不同。要全面地综合评价核受体干扰物的环境生态安全，只有哺乳类或鱼类的数据是远远不够的。来自不同分类地位物种数据的加入，将大大提高报告基因体外检测系统的可靠性和应用范围[68]。

此外，在维甲酸和维甲酸X受体干扰物的作用机制研究方面，也有许多工作尚待开展。哺乳动物的研究表明，RXR可与很多核受体形成异源二聚体而发挥多种生物学功能。维甲酸X受体干扰物的典型代表有机锡，对腹足类和哺乳动物毒性效应明显不同，前者是性畸变，后者是致肥胖，可能与哺乳动物RXR另一重要配体过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)的参与密切相关。研究者可应用受体报告基因实验，研究RXR与不同受体之间的相互作用以及各种辅调因子的调节机制，探讨该类污染物对不同生物的毒性机制。

[1] Word Health Organization. Global Assessment of the State-of-the-Science of Endocrine Disruptors [R]. Geneva: WHO, 2002

[2] Jiao B, Yeung E K, Chan C B, et al. Establishment of a transgenic yeast screening system for estrogenicity and identification of the anti-estrogenic activity of malachite green [J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2008, 105(6): 1399-1409

[3] Chatterjee S, Majumder C B, Roy P. Development of a yeast-based assay to determine the (anti) androgenic contaminants from pulp and paper mill effluents in India [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2007, 24(2): 114-121

[4] Jobling S, Reynolds T, White M G, et al. A variety of environmentally persistent chemicals, including some phthalate plasticizers, are weakly estrogenic [J]. Environmental Health Perspectives, 1995, 103(6): 582-587

[5] Ohno K, Azuma Y, Date K, et al. Evaluation of styrene oligomers eluted from polystyrene for estrogenicity in estrogen receptor binding assay, reporter gene assay, and uterotrophic assay [J]. Food and Chemical Toxicology, 2003, 41(1): 131-141

[6] Ibhazehiebo K, Iwasaki T, Kimura K J, et al. Disruption of thyroid hormone receptor mediated transcription and thyroid hormone induced purkinje cell dendrite arborization by polybrominated diphenyl ethers [J]. Environmental Health Perspectives, 2011, 119(2): 168-175

[7] Xiong Y, Ibhazehiebo K, Iwasaki T, et al. An in vitro method to study the effects of thyroid hormone-disrupting chemicals on neuronal development [J]. Neurotoxicology, 2012, 33(4): 753-757

[8] Jiang W, Yan Y, Li N, et al. Retinoid X receptor activities of source waters in China and their removal efficiencies during drinking water treatment processes [J]. Chinese Science Bulletin, 2012, 57(6): 595-600

[9] Kamata R, Shiraishi F, Nishikawa J, et al. Screening and detection of the in vitro agonistic activity of xenobiotics on the retinoic acid receptor [J]. Toxicology in Vitro, 2008, 22(4): 1050-1061

[10] Bryan G W, Gibbs P E, Hummerstone L G, et al. The decline of the gastropod Nucella lapillus around south-west England: Evidence for the effect of tributyltin from antifouling paints [J]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 1986, 66(3): 611-640

[11] Smith B S. Sexuality in the American mud snail, Nassarius obsoletus Say [J]. Journal of Molluscan Studies, 1971, 39(5): 377-378

[12] Horiguchi T, Nishikawa T, Ohta Y, et al. Retinoid X receptor gene expression and protein content in tissues of therockshell Thais clavigera [J]. AquaticToxicology, 2007,84(3): 379-388

[13] Maire L A, Grimaldi M, Roecklin D, et al. Activation of RXR PPAR heterodimers by organotin environmental endocrine disruptors [J]. EMBO reports, 2009, 10(4): 367-373

[14] Shimasaki Y, Kitano T, Oshima Y, et al. Tributyltin causes masculinization in fish [J]. Environmental Toxicology and Chemistry/SETAC, 2003, 22(1): 141-144

[15] McAllister B G, Kime D E. Early life exposure to environmental levels of the aromatase inhibitor tributyltin causes masculinisation and irreversible sperm damage in zebrafish (Danio rerio) [J]. Aquatic Toxicology, 2003, 65(3): 309-316

[16] Wang Y H, LeBlanc G A. Interactions of methyl farnesoate and related compounds with a crustacean retinoid X receptor [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2009, 309(1-2): 109-116

[17] 张纪亮, 朱文文, 熊建利, 等. 有机锡通过核受体干扰内分泌的研究进展[J]. 云南环境科学, 2011, 30(5): 4-6

Zhang J L, Zhu W W, Xiong J L, et al. Review on endocrine disrupting effects of organotins via nuclear receptor [J]. Yunnan Environmental Science, 2011, 30(5): 4-6 (in Chinese)

[18] Inadera H. The immune system as a target for environmental chemicals: Xenoestrogens and other compounds [J]. Toxicology Letters, 2006, 164(3): 191-206

[19] Verslycke T, Poelmans S, Wasch K D, et al. Testosterone metabolism in the estuarine mysid Neomysis integer (Crustacea; Mysidacea) following tributyltin exposure [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2003, 22(9): 2030-2036

[20] Shaw W V. Chloramphenicol acetyltransferase from chloramphenicol-resistant bacteria [J]. Methods in Enzymology, 1975, 43: 737-755

[21] 徐莉春. 环境内分泌干扰物筛选的受体报告基因试验研究[D]. 南京: 南京医科大学, 2005: 2-5

Xu L C. Study on receptor reporter gene assay for screening environmental endocrine disruptors [D]. Nanjing: Nanjing Medical University, 2005: 2-5 (in Chinese)

[22] Bonefeld-Jørgensen E C, Andersen H R, Rasmussen T H, et al. Effect of highly bioaccumulated polychlorinated biphenyl congeners on estrogen and androgen receptor activity [J]. Toxicology, 2001, 158(3): 141-153

[23] Xu H, Kraus W L, Shuler M L. Development of a stable dual cell-line GFP expression system to study estrogenic endocrine disruptors [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2008, 101(6): 1276-1287

[24] Yu R M, Wong M M, Kong R Y, et al. Induction of hepatic choriogenin mRNA expression in male marine medaka: A highly sensitive biomarker for environmental estrogens [J]. Aquatic Toxicology, 2006, 77(4): 348-358

[25] Kurauchi K, Nakaguchi Y, Tsutsumi M, et al. In vivo visual reporter system for detection of estrogen-like substances by transgenic medaka [J]. Environmental Science & Technology, 2005, 39(8): 2762-2768

[26] Sherf B A, Navarro S, Hannah R, et al. Dual-luciferase reporter assay: An advanced co-reporter technology integrating firefly and Renilla luciferase assays [J]. Promega Notes Magazine, 1996, 57: 2-8

[27] Thompson J F, Hayes L S, Lloyd D B. Modulation of firefly luciferase stability and impact on studies of gene regulation [J]. Gene, 1991, 103(2): 171-177

[28] Naylor L H. Reporter gene technology: The future looks bright [J]. Biochemical Pharmacology, 1999, 58(5): 749-757

[29] Oka T, Mitsui W N, Tatarazako N, et al. Establishment of transactivation assay systems using fish, amphibian, reptilian and human thyroid hormone receptors [J]. Journal of Applied Toxicology, 2013, 33(9): 991-1000

[30] Li J, Ma M, Wang Z J. A two-hybrid yeast assay to quantify the effects of xenobiotics on retinoid X receptor-mediated gene expression [J]. Toxicology Letters, 2008, 176(3): 198-206

[31] Cosnefroy A, Brion F, Maillot-Mar chal E, et al. Selective activation of zebrafish estrogen receptor subtypes by chemicals by using stable reporter gene assay developed in a zebrafish liver cell line [J]. Toxicological Sciences, 2012, 125(2): 439-449

[32] 李湘鸣, 罗方妮, 陈春波. 重组酵母细胞快速筛选环境雌激素系统的建立[J]. 环境与健康杂志, 2006, 23(2): 116-119

Li X M, Luo F N, Chen C B. Development of a rapid screening system of environmental estrogen based on recombinant yeast cell [J]. Journal of Environment and Health, 2006, 23(2): 116-119 (in Chinese)

[33] 郑怡文. 环境内分泌干扰物重组酵母检测系统的建立[D]. 上海: 第二军医大学, 2004: 77

Zhen Y W. Development of recombinant yeast screen systems for detecting environmental endocrine disruptors [D]. Shanghai: The Second Military Medical University, 2004: 77 (in Chinese)

[34] Balaguer P, Fran ois F, Comunale F, et al. Reporter cell lines to study the estrogenic effects of xenoestrogens [J]. The Science of the Total Environment, 1999, 233(1-3): 47-56

[35] Legler J, van den Brink C E, Brouwer A , et al. Development of a stably transfected estrogen receptor-mediated luciferase reporter gene assay in the human T47D breast cancer cell line [J]. Toxicological Sciences, 1999, 48(1): 55-66

[36] Kojima H, Iida M, Katsura E, et al. Effects of a diphenyl ether-type herbicide, chlornitrofen, and its amino derivative on androgen and estrogen receptor activities [J]. Environmental Health Perspectives, 2003, 111(4): 497-502

[37] 陈立敏, 吕秋军, 卞广兴, 等. 基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立[J]. 药学学报, 2006, 41(8): 721-726

Chen L M, Lu Q J, Bian G X, et al. Establishment of a reporter gene-based cell screening model for discovering new agonists of estrogen receptor β subtype [J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2006, 41(8): 721-726 (in Chinese)

[38] Lemaire G, Balaguer P, Michel S, et al. Activation of retinoic acid receptor-dependent transcription by organochlorine pesticides [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2005, 202(1): 38-49

[39] Shang Y, Brown M. Molecular determinants for the tissue specificity of SERMs [J]. Science, 2002, 295(5564): 2465-2468

[40] Smith C L, O'Malley B W. Coregulator function: A key to understanding tissue specificity of selective receptor modulators [J]. Endocrine Reviews, 2004, 25(1): 45-71

[41] Alsop D, Hewitt M, Kohli M, et al. Constituents within pulp mill effluent deplete retinoid stores in white sucker and bind to rainbow trout retinoic acid receptors and retinoid X receptors [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2003, 22(12): 2969-2976

[42] Ross S A, McCaffery P, Drager U, et al. Retinoids in embryonal development [J]. Physiological Reviews, 2000, 80(3): 1021-1054

[43] Sucov H M, Evans R M. Retinoic acid and retinoic acid receptors in development [J]. Molecular Neurobiology, 1995, 10(2-3): 169-184

[44] Kabiersch G, Rajasärkkä J, Tuomela M, et al. Bioluminescent yeast assay for detection of organotin compounds [J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(12): 5740-5745

[45] Kanayama T, Kobayashi N, Mamiya S, et al. Organotin compounds promote adipocyte differentiation as agonists of the peroxisome proliferator-activated receptor γ/retinoid X receptor pathway [J]. Molecular Pharmacology, 2005, 67(3): 766-774

[46] Inoue D, Sei K, Ike M. Disruption of retinoic acid receptor signaling by environmental pollutants [J]. Journal of Health Science, 2010, 56(3): 221-230

[47] Horiguchi T, Shiraishi H, Shimizu M, et al. Imposex in sea snails, caused by organotin (tributyltin and triphenyltin) pollution in Japan: A survey [J]. Applied Organometallic Chemistry, 1997, 11(5): 451-455

[48] Horiguchi T, Shiraishi H, Shimizu M, et al. Effects of triphenyltin chloride and five other organotin compounds on the development of imposex in the rock shell, Thais clavigera [J]. Environmental Pollution, 1997, 95(1): 85-91

[49] Grün F, Watanabe H, Zamanian Z, et al. Endocrine-disrupting organotin compounds are potent inducers of adipogenesis in vertebrates [J]. Molecular Endocrinology, 2006, 20(9): 2141-2155

[50] Fent K, Meier W. Effects of triphenyltin on fish early life stages [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 1994, 27(2): 224-231

[51] Shi H H, Zhu P, Guo S Z. Effects of tributyltin on metamorphosis and gonadal differentiation of Xenopus laevis at environmentally relevant concentrations [J]. Toxicology and Industrial Health, 2012, doi: 10.1177/0748233712457440

[52] Gardiner D, Ndayibagira A, Grün F, et al. Deformed frogs and environmental retinoids [J]. Pure and Applied Chemistry, 2003, 75(11): 2263-2273

[53] Inoue D, Nakama K, Matsui H, et al. Detection of agonistic activities against five human nuclear receptors in river environments of Japan using a yeast two-hybrid assay [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2009, 82(4): 399-404

[54] Inoue D, Nakama K, Sawada K, et al. Contamination with retinoic acid receptor agonists in two rivers in the Kinki region of Japan [J]. Water Research, 2010, 44(8): 2409-2418

[55] Inoue D, Nakama K, Sawada K, et al. Screening of agonistic activities against four nuclear receptors in wastewater treatment plants in Japan using a yeast two-hybrid assay [J]. Journal of Environmental Sciences, 2011, 23(1): 125-132

[56] Zhen H, Wu X, Hu J, et al. Identification of retinoic acid receptor agonists in sewage treatment plants [J]. Environmental Science & Technology, 2009, 43(17): 6611-6616

[57] 李剑, 饶凯锋, 马梅, 等.酵母双杂交技术构建重组维甲酸 X受体(RXR)基因酵母[J]. 科学通报, 2008, 53(17): 2028-2033

[58] 李剑, 孔东东, 王子健, 等. 污水处理厂出水维甲酸X受体干扰效应研究[J]. 北京理工大学学报, 2011, 31(2): 230-235

Li J, Kong D D, Wang Z J, et al. Study on the retinoid X receptor (RXR) disruption of effluents from wastewater treatment plant [J]. Journal of Beijing Institute of Technology, 2011, 31(2): 230-235 (in Chinese)

[59] Novák J, Benísek M, Pacherník J, et al. Interference of contaminated sediment extracts and environmental pollutants with retinoid signaling [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2007, 26(8): 1591-1599

[60] Novák, J, Beníšek M,těpánková T, et al. Assessment of retinoic activity in fly ash and air samples from polluted areas using P19/A15 cell line [C]. SETAC Europe 17th Annual Meeting-Abstract Book, Porto, 2007

[61] Urushitani H, Katsu Y, Ohta Y, et al. Cloning and characterization of retinoid X receptor (RXR) isoforms in the rock shell, Thais clavigera [J]. Aquatic Toxicology, 2011, 103(1-2): 101-111

[62] Urushitani H, Katsu Y, Ohta Y, et al. Cloning and characterization of the retinoic acid receptor-like protein in the rock shell, Thais clavigera [J]. Aquatic Toxicology, 2013, 142-143: 403-413

[63] Wilson V S, Cardon M C, Gray L E, et al. Competitive binding comparison of endocrine-disrupting compounds to recombinant androgen receptor from fathead minnow, rainbow trout, and human [J]. Environmental Toxicology and Chemistry/SETAC, 2007, 26(9): 1793-1802

[64] Wilson V S, Cardon M C, Thornton J, et al. Cloning and in vitro expression and characterization of the androgen receptor and isolation of estrogen receptor α from the fathead minnow (Pimephales promelas) [J]. Environmental Science & Technology, 2004, 38(23): 6314-6321

[65] Rider C V, Furr J, Wilson V S, et al. A mixture of seven antiandrogens induces reproductive malformations in rats [J]. International Journal of Andrology, 2008, 31(2): 249-262

[66] Katsu Y, Taniguchi E, Urushitani H, et al. Molecular cloning and characterization of ligand-and species-specificity of amphibian estrogen receptors [J]. General and Comparative Endocrinology, 2010, 168(2): 220-230

[67] 李维, 王淑红, 王艺磊, 等. 软体动物维甲酸X受体的研究进展[J]. 动物学杂志, 2013, 48(4): 655-664

Li W, Wang S H, Wang Y L, et al. Retinoid X receptor in mullusc [J]. Chinese Journal of Zoology, 2013, 48(4): 655-664 (in Chinese)

[68] Hotchkiss A K, Rider C V, Blystone C R, et al. Fifteen years after “Wingspread”— environmental endocrine disrupters and human and wildlife health: Where we are today and where we need to go [J]. Toxicological Sciences, 2008, 105(2): 235-259

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ReceptorReporterGeneAssayandItsApplicationinMonitoringofChemicalswithAntagonistorAgonistEffectstoRetinoicAcidReceptorsandRetinoidXReceptors

Zhong Enhui, Wang Yilei, Wang Shuhong*

Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China

12 September 2013accepted15 December 2013

Receptor reporter gene assay has been widely applied in high-throughput screening of environmental endocrine disrupting chemicals, on account of its advantages of rapid, economic, sensitive and convenient measurement. Some chemicals like organotin have shown antagonist or agonist effects to RAR (retinoic acid receptors) and/or RXR (retinoid X receptors), which make the usage of receptor reporter gene assay possible in this field. There are several reports about the screening and detection of these chemicals. Here, we reviewed the technology of receptor reporter gene assay, including the reporter gene and host cell selection, as well as its applications in screening and monitoring of chemicals with antagonist or agonist effect to RAR and/or RXR. The present review also discussed what should be done to improve the application of receptor reporter gene assay in order to provide some new insight in this field.

receptor reporter gene assay; retinoic acid receptor (RAR); retiniod X receptor (RXR)

国家自然科学基金(20877034)；福建省科技重点项目(2011N0022)；集美大学创新团队基金(2010A001)

钟恩惠(1988-)，女，硕士，研究方向为环境毒理学，E-mail: grace88zhong@gmail.com；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: shwang@jmu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130912002

钟恩惠，王艺磊，王淑红. 受体报告基因实验及其在维甲酸和维甲酸X受体监测中的应用[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(2): 319-328

Zhong E H，Wang Y L, Wang S H. Receptor reporter gene assay and its application in monitoring of chemicals with antagonist or agonist effects to RAR and RXR [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 319-328 (in Chinese)

2013-09-12录用日期2013-12-15

1673-5897(2014)2-319-10

X171.5

A

王淑红(1969—)，女，理学博士，副教授，主要研究方向为水生生态毒理学和水产动物生理学。