超突变细胞在进化工程中的开发与应用

栾国栋， 蔡 真， 李 寅

中国科学院微生物研究所，北京100101

微生物细胞性能的改造和提高是现代工业生物技术的核心问题，对生物炼制和生物经济发展有着重要意义［1～3］。进化工程是改造微生物细胞各种复杂生理表型的主要策略和手段。尽管进化工程新理论、新技术和新工具的开发已取得了巨大的进展和成果，但是诱变筛选［4］、连续驯化［5，6］和组合工程［7］等现行各种技术手段仍存在着不同程度的进化效率低、对人工介入依赖性强、连续性差的问题和缺陷［8］。近年来，生物技术领域对超突变微生物细胞的认识和应用为进化工程的发展指明了新的方向。通过设计开发人工可控的微生物细胞超突变系统，可以实现连续便捷的胞内自动诱变，推动完成真正高效、连续、自动化的微生物菌株选育，极大地提高细胞性能改造的效率和效果。本文将对超突变细胞的产生机制、构建策略及其在进化工程和生物技术领域中的应用进行概述，并探讨其未来发展的可能方向。

1 进化工程

进化工程(evolutionary engineering)是一种模拟自然界进化中的变异－选择过程，通过人工选择实现微生物的定向进化，筛选获得优良菌株的育种技术。进化工程通过对基因组突变的选择和积累，实现对细胞表型的定向改造，其应用并不依赖于对菌株遗传背景的认识，因此特别适合对反应机制不清楚或有大量基因产物参与的复杂生理表型的改造［6，9］。

变异与选择是进化的两个关键环节。变异是指遗传型的改变引发表型的改变，在特定的选择压力下表现为个体间适应性的差异;选择是指在特定选择压力下对微生物细胞抑制性培养，造成细胞间的生存竞争，使菌群从遗传到表型向着特定方向变化。进化工程实际操作中还包括筛选的步骤，即在菌群进化的最终阶段从培养液中存在的不同突变体中精选出最符合需要的菌株。为了获得具有理想表型的工业微生物菌株，通常要进行反复的“变异－选择－筛选”流程，即以前一轮进化获得的优良菌株为出发菌进行下一轮进化，实现表型的连续改良［10，11］。

变异是进化工程的基础，微生物菌群遗传型和表型的多样性从根本上决定最终是否能获得性能得到提高的菌株。传统进化工程技术通过连续传代来积累基因组复制过程中的随机突变，但是基因组复制过程中自然突变率极低［12～14］，极大地限制了进化工程的效率;为了提高基因组复制突变率，在菌株改造过程中会使用各种理化诱变剂处理细胞，引发DNA复制错误，加快突变产生，但是诱变剂的使用会对细胞造成极大伤害，而且容易使细胞对特定诱变剂产生抗性。近年来又出现了以随机敲除和随机过量表达、人工转录因子工程、全局转录机器工程、核糖体工程和基因组改组为代表的多种新型进化工程技术，能够高效地扰动复杂的细胞生理与代谢网络，在菌群中引入多样性，为表型筛选提供材料［7］。但其实施过程依赖于遗传操作，需要反复的人工操作，降低了整个进化工程的效率和连续性。

理想的进化工程技术应该同时具备过程的连续性和进化的高效性，也即需要进化体系中的微生物细胞群体能够不依赖于人工介入就可以迅速地产生遗传多样性，并在筛选压力下完成适应性进化。具有较高基因组复制突变率的超突变细胞可以充分满足这一要求，并在进化工程领域表现出巨大的应用潜力。

2 超突变细胞的产生与构建

2.1 超突变细胞的产生机制

超突变细胞是指基因组复制突变率较高，DNA复制过程中产生大量随机突变的细胞。正常情况下，微生物细胞DNA复制保真性极高，碱基突变率大约为 10－10～ 10－9/复制［12～14］。DNA复制的高度精确性保证了遗传信息的稳定传递和物种性状的稳定遗传，在稳定环境下有利于生物种群有效保持其经过自然选择优化过的环境适应性［12，15］，这种高度精确性是由复杂的、多层次的保真机制来维持的，主要包括碱基选择、3'→5'外切校正、甲基化介导DNA错配修复(MMR)和DNA 损伤修复等［14，16，17］。DNA 聚合酶对碱基的正确选择是复制准确性的第一道保证，也是最根本的保证，只有正确配对的碱基对(A-T/G-C)才能满足DNA聚合反应时聚合酶生化与结构上的要求，因此保证了整个反应的高度准确性，以大肠杆菌中最主要的DNA聚合酶DNA PolⅢ为例，其核心酶体催化反应过程中碱基错配概率仅为10－5～10－4。而错配一旦发生，其带来的聚合酶复合物构型变化会终止反应，随即聚合酶中具有3'→5'外切酶活性的ε亚基会立即将错误碱基切除并重启反应，3'→5'外切校正将DNA复制的保真性提高了2～3个数量级。MMR系统是相对独立于DNA聚合过程以外的复制错误校正系统，该系统发挥作用通常依赖于Dam甲基化机制。当DNA复制碱基错误配对形成时，MMR系统会迅速识别配对错误，并根据新链/旧链Dam甲基化程度的差异，将新生链上由错误碱基开始的一段序列切除。大肠杆菌中由MutS、MutL、MutH在内的一系列功能元件参与的MMR机制将DNA复制保真性提高了1～2个数量级。除了对DNA复制过程中发生的错误进行识别和校正以外，对胞内DNA损伤的修复也起着重要的保真作用。例如，DNA双链中鸟嘌呤(G)可能被氧化形成8-oxoG，并在DNA复制时与腺嘌呤(A)配对从而导致突变，糖基酶MutM能将8-oxoG切除，以保证修复后复制时发生准确的G-C配对。另一种糖基酶MutY则可以在8-oxoG-A配对形成时将A切除，使8-oxoG-C配对在短时间内继续保持，为MutM 修复争取时间［16，18，19］。复杂的、层级式的保真机制保证了DNA复制过程的高度精确性，而当其中相关基因发生结构性的、可遗传的功能缺陷甚至失活时，就会在不同程度上影响DNA复制的保真性，影响遗传信息的准确传递，形成超突变细胞。

此外，天然细胞在营养极度缺乏、环境压力胁迫严重时，也会激发一系列全局性应激机制，造成基因组不稳定性加强，复制突变率提高，形成暂时性的超突变状态［20，21］。压力应激条件诱导产生细胞突变机制尚未得到完全公认的解释，其中涉及的元件或机制包括σ因子RpoS表达上调，SOS系统激发，Pol VI、Pol V等易错型DNA聚合酶表达上调以及MMR系统表达下调等，而胁迫条件下胞内各种造成DNA损伤的因子(例如ROS、H2O2等)的含量通常也会大量增加，进一步促进DNA复制突变率的提高［22］。

2.2 超突变细胞的人工构建

超突变细胞较高的基因组复制突变率，可以为微生物进化提供更强的动力，因此超突变细胞在进化工程和生物技术领域具有得天独厚的优势和潜力。但是天然超突变细胞在自然界中以非常低的比率存在着，而且存在着遗传背景不清楚、生理表型不明确、系统可控性差等问题，在一定程度上限制了其有效应用。为了充分利用超突变细胞，更好的选择是从背景清晰、表型明确的宿主菌株出发构建人工可控的超突变细胞。现阶段对DNA 复制机制的充分认识［23，24］，大量增变/抑变基因的发现，为超突变细胞的构建提供了大量操作靶点［16］，而各种遗传操作的工具的出现和发展进一步使得对细胞突变状态进行人工调控成为可能。

现阶段，人工构建超突变细胞的策略主要包括以下几种:①通过基因敲除手段失活非生长必须型保真元件。对于以MMR系统中MutS、MutL为代表的非生长必需型保真元件来说，通过直接的基因敲除就可以实现相关机制的失活，引发DNA复制突变率的提高，并且不会影响到宿主的正常生长［25～27］;②通过遗传修饰降低或消除生长必须型保真元件的保真活性。参与DNA复制保真机制的很多元件与DNA的复制过程直接相关，是细胞生长、复制所必须的，以大肠杆菌为例，其dnaE，dnaQ，polA等都是重要的保真元件 ，又是细胞生长的必需基因。针对此类靶标，通过解析其序列、结构和功能的关系，对特定位点进行操作，在不影响其DNA复制功能的前提下，消除或降低其校正活性，也可以起到提高复制突变率的效果［28，29］;③通过上调表达细胞内具有增变活性的元件或蛋白。微生物细胞中除了大量DNA复制保真元件外，还包含有部分对复制保真性有负面作用的基因，通常称之为增变元件，例如压力应激突变系统的各个组分，当在正常条件下人工上调此类基因表达时，即可使细胞进入超突变状态［30］。

3 超突变细胞的应用

超突变细胞基因组中快速获得并积累的随机突变能够制造丰富的遗传和表型多样性，以供性状筛选，因此可以用于快速改造微生物细胞表型;另一方面，超突变细胞中较高的复制错误率，也使其成为一种便捷的DNA诱变工具，将目标基因以质粒携带的形式导入超突变细胞进行复制传代后，就可以便捷地获得目标基因的突变体文库。因此，超突变细胞在蛋白质和微生物的进化工程方面有着广泛的应用前景。

3.1 应用超突变细胞进化细胞生理表型

传统进化工程技术为了改造微生物细胞底物利用能力、环境耐受性等复杂表型需要通过连续传代的手段，经过长期驯化，逐渐积累基因组中的随机突变来达到改良细胞表型的目的［5，6］。为了加速进化过程，往往会使用理化诱变剂处理、转座子诱变等手段来加速基因组范围内突变产生的速度［10，31］。超突变细胞本身具有的基因组复制高突变率的特点使其在应用于表型筛选改造时具有连续、高效的特点，无需进行人工处理，即可在子代细胞基因组上生成大量突变，进而形成表型多样性以供筛选。

将超突变细胞应用于微生物的生理表型改造最早报道于2001年，Genencor公司的Selifonova等［32］使用外源质粒表达大肠杆菌强增变基因mutD5，使细胞的基因组复制突变率提高了近4 000倍，在此基础上，经过两轮筛选就获得了对有机溶剂DMF的耐受浓度提高10～20 g/L的进化菌株，在DMF耐受细胞中只要将外源质粒消除，基因组复制突变率就能回复正常，使表型得以稳定遗传。Zhu等［33］通过敲除大肠杆菌的mutS基因，获得了突变率提高100倍左右的超突变菌株，经过进化成功地提高了宿主对丁醇、NaCl以及高温胁迫的耐受能力。Endo等［34］将枯草芽孢杆菌超突变细胞用于加速菌株的温度适应性进化。在一株因GroEL基因替换而表现为热耐受性减弱(52℃→50℃)的枯草芽孢杆菌的基础上，通过敲除mutS、mutM和mutY基因形成了超突变细胞，经过选择成功地使宿主的温度耐受性回复到了野生型的水平。Itakura等［35］通过对根瘤菌(Bradyhizobium japonicum)中编码DNA聚合酶Ⅲ复合物ε亚基的dnaQ基因进行定点突变，使其关键的保守区域ExoI中重要的活性氨基酸位点Asp7和Glu9突变为Ala，成功地构建了超突变菌株并应用于驯化，最终获得的突变菌株表现出比野生型高7～12倍的N2O呼吸活性。在真核细胞中，人工构建超突变细胞主要通过对其DNA聚合酶3(delta)进行改造。早在1993年，Morrison等［36］将酿酒酵母DNA聚合酶Pol3中负责3'→5'外切酶活性的氨基酸保守区域“Phe-Asp-Ile-Glu-Thr”进行定点突变改为“Phe-Ala-Ile-Ala-Thr”(由Pol3基因突变为Pol3-01)，获得的菌株突变率相比野生型提高了130倍，而正常生长未受影响，而将所获得工程菌株中参与MMR校正的pms基因敲除时，细胞突变率甚至提高了19 000倍。类似的对DNA聚合酶2中相同保守区域进行改造时，宿主的DNA复制突变率也有了22倍的提高［37］。2006年，Shimoda等［38］从染色体上表达 Pol3-01的酿酒酵母超突变菌株出发，经过进化获得了能够耐受40℃高温胁迫的突变株。Abe等［39，40］则使用质粒表达Pol3-01来提高酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(相应的同源基因氨基酸保守区域进行了与Pol3-01类似的突变)的基因组复制突变率，通过进化成功改造了酵母菌对乙醇的耐受性和药物蛋白合成分泌的能力。2013年韩国研究人员采用类似的策略构建了汉逊酵母(Hansenula anomala)的超突变细胞，进行全基因随机突变，并筛选到对木糖利用能力提高的进化菌株［41］。

本实验室针对进化工程技术对连续性和高效性的要求，设计开发了基因组复制工程辅助的连续进化技术(genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE)，以“边突变边筛选”为设计原则，通过向微生物细胞中导入一组进行了遗传修饰的DNA聚合酶保真元件突变体来扰动基因组复制过程的保真性进而构建超突变细胞。当细胞在不断加强的选择性压力下培养时，只有不断富集适应性突变的子代细胞才能存活并被筛选;当保真元件突变体被消除的时候，就可以获得具备优良、可遗传表型的突变菌株。在E.coli细胞中，我们应用易错PCR技术构建了DNA聚合酶Ⅲ复合物ε亚基的dnaQ基因的突变体文库，导入宿主细胞后在胁迫环境下连续培养，在两个月的时间内成功地将细胞丁醇耐受浓度由6 g/L提高到10 g/L，将0.1%浓度乙酸环境中细胞饱和浓度提高了8倍［8］。

GREACE应用过程还反映出不同性状的改造过程中宿主倾向于富集突变强度不同的保真元件(dnaQ)突变体的趋势，意味着微生物细胞在不同环境中的适应与进化可能偏好于不同强度的突变率，也印证了GREACE技术设计过程中对不同突变率需要进行考虑的必要性。针对基因组复制突变率控制的需要，Luan等［26］进一步在重要的工业菌株丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)中提出并开发了一套可控性超突变系统，通过将基因组mutS/mutL敲除失活，再将由无水四环素诱导型启动子控制的mutS/mutL操纵子通过质粒导回细胞，成功实现了对梭菌细胞基因组复制突变率的人工精细调控，通过调整无水四环素的浓度，可以实现在本底强度到提高120倍范围内的变化。应用该系统处于超突变状态下的梭菌细胞表现出明显增强的丁醇耐受性，反映了该系统的应用潜力。

3.2 应用超突变细胞进行基因突变文库构建

定向进化技术是进化论和进化工程理论在酶工程领域的重要应用，该技术不需要或不依赖于对待改造蛋白的高级结构和功能方面的认识，而主要通过构建基因－蛋白突变体文库并结合高通量筛选的策略来获得酶学性质有所改善提高或具备新的催化活性的酶蛋白突变体［42］。构建具有丰富的遗传多样性的突变体文库对定向进化技术的成功应用具有重要意义。传统上，定向进化技术主要是通过易错 PCR(error-prone PCR，EPPCR)或DNA shuffling的手段来构建待改造蛋白的突变体文库。近年来，超突变细胞的胞内诱变体系在该领域也表现出巨大的应用潜力和价值。

1997年，Stratagene公司的研究人员构建了第一个可用于构建基因突变体文库的大肠杆菌菌株XL1-Red。XL1-Red菌株中，3'→5'外切校正系统(mutD/dnaQ)、MMR系统(mutS)和DNA修复系统(mutT)的相关基因都进行了改造，其基因组复制随机突变率比野生型大肠杆菌高5 000倍以上，使用ColE1复制起始位点的质粒携带目标基因在XL1-Red菌株中传代培养时，宿主仅需复制24代，就能使1 kb长度的目标基因上平均引入1个突变，而野生菌达到相同水平的突变效果需进行120 000代复制［43］。XL1-Red系统使用时只需将待突变建库的目标基因插入ColE1来源的质粒后，转入XL1-Red，根据需要的突变率，在合适的时间内传代培养细胞，然后将质粒抽提出来就获得了突变体文库［43］。XL1-Red系统已经成功地应用于酯酶［44，45］、葡萄糖醛酸酶［46］、芳基丙二酸脱羧酶［47］以及聚羟基脂肪酸酯合酶［48］等大量酶蛋白的定向进化，从中筛选到了活性、稳定性、专一性等性质有所提高的各种突变体，甚至噬菌体抗性蛋白［49］、肝炎病毒抗体［50］等特殊蛋白的进化或改造也可以使用该系统进行。

XL1-Red系统能够有效地向外源质粒上的DNA片段引入突变，但是理论上该系统对细胞内DNA的突变是无差别的，无论是基因组DNA还是质粒DNA都以近乎相同的强度进行突变，同时还造成了菌株细胞本身极大的不稳定性。理想的用于蛋白质定向进化的胞内突变机制应该是靶向性的，可以集中对特定区域的DNA进行诱变。Loeb 等［51，52］开发了一套新的基于易错型 DNA PolⅠ的胞内诱变系统，在DNA胞内突变的靶向性上取得了很大的进展。大肠杆菌细胞中ColE1来源的质粒DNA复制起始是由PolⅠ来执行的，Loeb实验室通过对PolⅠ的突变和改造，获得了大量增变型突变体，会引发宿主细胞基因组复制保真性的提高或降低。将保真性降低的易错型PolⅠ编码基因在质粒载体(非ColEI来源)上表达，在此基础上将目标基因连入ColE1质粒并导入宿主后，就可以进行突变建库。分析证明，使用该系统进行突变体文库构建时突变效率与目标基因的长度以及与PolⅠ结合位点的距离直接相关，为了满足不同的建库要求，需要有针对性地进行设计。虽然该体系尚未能实现完全地将突变限制在质粒上，但是对目标基因的突变率还是比基因组DNA突变率高一个数量级以上。

4 展望

高通量测序技术的不断发展，对细胞DNA复制保真机制认识的不断加深以及新型高效遗传操作工具的不断涌现，使得构建各种特殊性质的超突变细胞成为可能。而随着进化工程相关领域理解和认识的加深，对人工构建超突变细胞的各种性质也有了新的要求。未来的人工可控超突变细胞发展方向是:①超突变态/正常态的便捷切换;②不同程度突变强度的精细调控;③不同DNA突变类型的平衡引入;④特定区域DNA的定向集中突变。在突变的时序、空间和强度上都具备良好人工可控性的超突变细胞将为微生物细胞和蛋白的进化提供更强更好的进化动力，有效地满足各种性状改善提高的需要，从而促进生物技术在不同领域的应用和发展。

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