天然虾青素提取及分离纯化研究进展

武一琛，杨慧茹，方园，任秀莲

（哈尔滨工业大学（威海）海洋科学与技术学院，山东威海264209）

虾青素（Astaxanthin）即 3，3’-二羟基-β，β’-胡萝卜素-4，4’-二酮，由于结构内部的共轭不饱和双键，是一种极强的抗氧化剂，在抗氧化、着色、促进动物繁殖、增强人体免疫能力、保护心脑血管及中枢神经方面具有优良的生物学功能[1]，可以作为自由基清除剂和免疫调节剂[2]等应用。

天然虾青素富含于虾蟹的壳、雨生红球藻、法夫酵母等[3]。目前我国海洋虾蟹制品下脚料利用率极低，大部分都是直接丢弃。如果把虾蟹制品的下脚料加以回收，提取其中的虾青素并进行有效的利用，在给企业带来不菲的经济效益的同时，也减少了环境的污染，提高了虾蟹下脚料的综合利用率，具有极其广阔的应用前景。雨生红球藻和法夫酵母生长周期短，便于人工的养殖和控制，在提取天然虾青素方向同样有巨大的发展空间，近年来一直是国内外专家学者研究的热点问题。

1 天然虾青素提取工艺

天然虾青素的提取方法有碱提法、酸溶法、有机萃取法、负压空化法、酶解法、超临界流体萃取法、微波处理提取法等，其中碱提法和酸溶法由于工艺落后，需要消耗大量碱和有机酸，直接导致污水排放增加，对环境中水源污染严重，近几年已逐渐退出历史舞台。

1.1 有机萃取法

有机萃取法是通过有机溶剂萃取而使目标产物进行富集从而分离。常用的有机萃取剂有乙醇、丙酮、甲醇、苯、石油醚等，根据目标产物的极性和其它理化性质，不同的有机溶剂的萃取效果不同。

MIQUEL GIMENO 等[4]通过用乙醇，丙酮，1，1，1，2-四氟乙烷液体溶剂对虾残留物萃取天然游离虾青素，通过HPLC分析，丙酮萃取游离虾青素的提取率最高，达115 μg/g虾残留物。此外，液态的四氟乙烷为首次作为溶剂成功提取分离出天然虾青素。这与Ruenngam D等[5]的研究结果结论一致。Ruen-ngam D研究发现：利用丙酮、甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂萃取雨生红球藻中的虾青素，丙酮的提取率最高。

绝大多数的有机溶剂有毒性，随着科技的发展和标准的提高，残留的有机溶剂的毒性大大制约了有机萃取法的发展，于是各种新型方法不断涌现。

1.2 负压空化法

负压空化法是一种新兴的提取方法，通过负压空化气泡产生剧烈的机械振动，从而使细胞壁破裂，目标提取物从中分离出来。由于负压产生的强烈的压强差，使提取溶剂在瞬间进入细胞壁，大大缩短了提取分离的时间，具有广阔的应用前景[6]。目前研究采用负压空化法提取天然虾青素的主要有东北林业大学等。

祖元刚等[6]对负压空化法进行了优化和处理，研究发现：提取溶剂为质量分数80%的乙醇溶液、提取时间为35 min、通气量为0.2 m3/h时，为提取法夫酵母中的虾青素的最佳工艺参数，且不会破坏法夫酵母的细胞壁。

1.3 酶解法

酶解法是对原料虾壳蟹壳进行预处理后，加入一定的具有生物活性的酶对其中的蛋白质进行酶解，沉降分离蛋白质的同时分离制取虾青素的方法。Toshihiro Nagao等[7]利用铜绿假单胞菌脂肪酶分离出虾青素，赵仪等[8]研究发现利用木瓜蛋白酶处理废弃的虾壳，使蛋白质沉降同时分离虾青素的方法比利用有机溶剂提取的提取率提高了19.879%，达到63.059μg/g。蹇华丽等[9]采用单因素及均匀实验法将环状芽孢杆菌胞壁溶解酶作用于法夫酵母，研究发现了破壁提取虾青素的最佳酶作用条件，即粗酶液pH为5.0，体积为33 mL（酶量1 603.8 U/g干酵母），温度37℃，100 r/min振荡反应16.5 h虾青素的提取率可达到98%以上。姜淼等[10]研究内源酶辅助提取虾壳中的天然虾青素的实验也取得了一定进展。

为解决直接加酶导致成本过高的问题，可以尝试将产酶菌株与法夫酵母或者雨生红球藻共同进行培养[11]，但是由于适宜的生长条件：pH、水分、培养基成分、温度等都不相同，所以该方法进展缓慢。酶解法提取的虾青素具有无毒、无溶剂残留、操作简便等优点，只要解决了成本问题，酶解法分离虾青素就可以产业化，具有极大的经济效益和发展前景。

1.4 超临界流体萃取法

超临界流体萃取技术利用超临界流体的性质，高压条件时与虾壳粉碎物接触并混合，萃取出其中的虾青素，之后再利用改变条件的方法使超临界流体中的萃取物分离出来。超临界流体萃取法在虾青素的提取方面的主要手段是超临界CO2流体法。

Siti Machmudah等[12]研究超临界CO2流体法提取天然虾青素，发现以乙醇作为夹带剂时，提取率更高。屈毅等[13]运用超临界CO2流体法研究发现：最佳萃取工艺参数为萃取压力40 MPa，萃取温度60℃，此时虾壳中虾青素的提取率可达到80.5%，并且得到的副产物（虾油等）较少。Hyun-Seok Youn等[14]，刘洪超等[15]也探讨了超临界CO2流体提取虾青素的方法。

超临界流体萃取法是利用物理原理对目标物质进行分离的方法，无毒性和有害残留，而且分离较彻底。同时，超临界流体法目前只是处于实验室研究阶段，想要投入工业生产中存在机器费用及维修费用高、生产技术复杂、整个工艺流程具有不确定隐患的一系列困难。已经有越来越多的专家学者投入到了这方面的研究中。

1.5 微波处理提取法

微波处理提取法是用不同波长和频率的微波处理含有目标提取物的混合物，使其理化性质发生改变而提高提取率的方法。目前微波处理提取法用于天然虾青素分离提取的研究还处于初步的尝试阶段。Liyan Zhao等[16]研究发现在条件：微波功率为141 W，提取时间为83 s，溶剂用量9.8 mL，提取4次时，100 mg雨生红球藻的干燥粉末可以提取约（594±3.02）μg天然虾青素，这一研究创造了微波法用于提取天然虾青素的记录。

2 天然虾青素分离纯化工艺

纯化就是把经过粗提的样品中所含有的杂质除去，使目标物质的纯度最大化的过程。常用的初级分离纯化方法分为：液-液萃取、沉淀法、膜分离法、结晶法等。更高级的分离纯化还有：薄层层析、柱层析、高效液相色谱等方法[17]。

针对天然虾青素极其不稳定、易分解、易变质的性质，学者们对天然虾青素的分离纯化做了多层次、多角度的研究，并取得了一些成果。

2.1 薄层层析

薄层层析（Thin Layer Chromatography，TLC）的固定相多为硅胶，不会对虾青素产生影响，但由于薄层层析的分离度不高，结果受外界干扰因素大，重现性差，不便于实验操作，所以对操作过程要求极高。

郭建瑞等[18]在研究中选用石油醚、丙酮、乙酸乙酯两两组合作为流动相进行比较分析。通过改变其组成比例发现：石油醚乙酸乙酯质量比为2∶1（体积比）的展开剂分离效果较好，薄板上分离出清晰的4个点。陈兴才等[19]在研究虾青素分离纯化时，也应用了薄层层析的方法。

2.2 柱层析

柱层析是最常用的纯化方法之一，与其他色谱方法相比，柱层析设备低廉，更换固定相和流动相方便；虽然柱效不是特别高，但是利用不同固定相和流动相的组合能够实现一些相对简单样品的分离与纯化，应用范围很广。

黄萌[20]在虾青素的分离纯化中采用柱层析的方法，游离虾青素在流动相为正己烷与丙酮1∶1（体积比）时被洗脱下来，纯度达到99.36%。杨磊等[21]采用连续中压硅胶柱层析纯化虾青素得到纯度大于97%的虾青素产品，平均回收率大于60%。张琇等[22]以聚酰胺为固定相，获得虾青素的纯度为92.9%。

2.3 高效液相色谱法

高效薄层色谱法（High Performance Thin Layer Chromatography，HPTLC）已经在天然产物的分离与纯化领域得到了广泛应用，成为一种简便、高效的分析方法。

陈兴才等[17]使用高效液相色谱法结合折光示差检测器对虾青素的纯度进行了测定达到98%以上。Karsten Holtin[23]等也利用HPLC分析出了虾青素的合适吸收值。牟志春等[24]建立了虾青素手性异构体分离和检测的HPLC方法，用来快速鉴别养殖三文鱼是否使用了人工合成虾青素。

与薄层层析和柱层析相比，高效液相色谱的仪器价格高昂，需要定时维修检查，使用时对仪器的磨损度大，无法在工业企业中大规模普及。

3 结语及展望

由于虾青素本身极其不稳定的性质，在其提取与分离纯化中有重要影响。在虾青素的提取中，负压空化法、酶解法、超临界流体萃取法、微波处理提取法都是一些新兴的分离方法，具有广阔的发展和应用前景。相信在不远的将来，这些方法会应用于工业化生产；在分离纯化方面，层析法应用最为广泛，HPLC法分离效果更好，造价高。

虾青素具有抗氧化、着色等功效，梁春玮等[25]总结出虾青素具有明显的抗癌和改善人体视网膜和骨质量的功效，在药物及食品方面应用广泛；同时具有显著的着色功能，未来可以研究用虾青素代替被禁止使用的苏丹红IV给食品进行染色。同时，我们要看到国外已经有成熟的虾青素生产技术和专利，如日本的Toshihiro Nagao等[7]已经把酶解法分离雨生红球藻中的虾青素应用于大规模的工业生产，如果国内在这个领域有所成就，对虾青素的价格居高不下和技术的掌握都有重大意义。

[1]姜启兴,夏文水.龙虾壳中色素的稳定性研究[J].食品科学,2006,27(7):61-64

[2]G.Goswami S,Chaudhuri D,Dutta.The present perspective of Astaxanthin with reference to biosynthesis and pharmacological importance[J].World J Microbiol Biotechnol,2010,26:1925-1939

[3]Higuera-Ciapara,L.Félix-Valenzuela,F.M.Goycoolea.Astaxanthin:A Review of its Chemistry and Applications[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2007,46(2):185-196

[4]MIQUELGIMENO,JESSICAYESEMITERAMÍREZ-HERNÁNDEZ,CÉSAR MÁRTINEZ IBARRA,et al.One-Solvent Extraction of AstaxanthinfromLacticAcidFermentedShrimpWastes[J].J Agric Food Chem,2007,55:10345-10350

[5]Ruen-ngam D,Shotipruk A,Pavasant P.Comparison of extraction methods for recovery of astaxanthin from Haematococcus pluvialis[J].Separation Science and Technology,2011,46(1):64-70

[6]祖元刚,刘莉娜,薛艳华,等.负压空化法提取虾青素[J].东北林业大学学报,2007,35(2):59-60

[7]Toshihiro Nagao,Tadashi Fukami,Yoshiharu Horita,et al.Enzymatic Enrichment of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis Cell Extracts[J].JAOCS,2003,80:975-981

[8]赵仪,陈兴才.木瓜蛋白酶在虾仁加工废弃物中提取虾青索的应用[J].福州大学学报,2006(3):453-457

[9]蹇华丽,朱明军,吴振强,等.环状芽孢杆菌胞壁溶解酶用于红发夫酵母虾青素提取的研究[J].高校化学工程学报,2006,20(1):147-151

[10]姜淼,杨贤庆,李来好,等.内源酶辅助提取虾壳虾青素的研究[J].南方水产科学,2011,7(2):55-60

[11]宋光均,蹇华丽.发夫红酵母虾青素提取分离技术的研究进展[J].大众科技,2005(6):60-62

[12]Siti Machmudah,Artiwan Shotipruk,Motonobu Goto,et al.Extraction of Astaxanthin from Haematococcus pluWialis Using Supercritical CO2and Ethanol as Entrainer[J].Ind Eng Chem Res,2006,45,3652-3657

[13]屈毅,倪晋仁,黄文超.临界CO2流体提取虾青素的工艺研究[J].食品与发酵工业,2004,30(12):80-82

[14]Hyun-Seok Youn,Myong-Kyun Roh,Andreas Weber,et al.Solubilityofastaxanthininsupercriticalcarbondioxide[J].KoreanJChem.Eng,2007,24(5):831-834

[15]刘宏超,杨丹.从虾壳中提取虾青素工艺及其生物活性应用研究进展[J].化学试剂,2009,31(2):105-108

[16]Liyan Zhao,Guitang Chen,Guanghua Zhao,et al.Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Astaxanthin from Haematococcus Pluvialis by Response Surface Methodology and Antioxidant Activities of the Extracts[J].Separation Science and Technology,2009,44(1):243-262

[17]董建勇.天然药物化学[M].浙江:浙江大学出版社,2011:22-30

[18]郭建瑞,许激扬.红酵母RY-4中虾青素的分离纯化研究[J].天然产物研究与开发,2007,19(5):858-861

[19]陈兴才,黄伟光,欧阳琴.雨生红球藻中虾青素酯的皂化及游离虾青素的纯化分离[J].福州大学学报,2005,33(2):265-268

[20]黄萌.南极磷虾中虾青素的提取与纯化[D].济南:山东师范大学,2012

[21]杨磊,卫蔚,刘婷婷,等.连续中压硅胶柱层析纯化法夫酵母虾青素[J].化工进展,2010,20(6):1125-1128

[22]张琇,钟丽晶,马爱瑛,等.红酵母虾青素的分离与纯化初探[J].中国农学通报,2011,27(2):405-409

[23]Karsten Holtin,Maximilian Kuehnle,Jens Rehbein,et al.Determination of Astaxanthin and Astaxanthin esters in the microalgae Haematococcus pluvialis by LC-(APCI)MS and characterization of predominant carotenoid isomers by NMR spectroscopy[J].Anal Bioanal Chem,2009,395:1613-1622

[24]牟志春,张明,张艺兵,等.高效液相色谱法快速鉴别人工合成虾青素养殖的三文鱼[J].食品科学,2009,30(22):318-320

[25]梁春玮,刘静波.海鸭蛋中类胡萝卜素生化特性及提纯的研究现状[C].第九届中国蛋品科技大会论文集,吉林,长春,2010