睾丸细胞生物学研究进展

祝辉，崔毓桂，周作民

（1．南京医科大学生殖医学国家重点实验室；2．南京医科大学第一附属医院生殖医学科，南京210029）

睾丸是男性生殖腺，能产生精子和分泌雄激素。成人睾丸长约4．5cm，宽约2．5cm，厚约3．0cm，重约12g。睾丸实质被睾丸小隔分成200～300个睾丸小叶，每个睾丸小叶含1～4条曲细精管，管腔的周围为结缔组织构成的间质。曲细精管主要由生精细胞和支持细胞（Sertoli cell）组成，是精子发生场所；间质中主要含间质细胞（Leydig cell），合成与分泌雄激素［1－2］。睾丸功能依赖生精细胞、支持细胞和间质细胞的正常发育分化，从而形成正常的细胞结构，并在特定时期有序地表达相关基因／蛋白质，以保证精子生成和雄激素分泌。本文简介睾丸细胞的发育分化，着重睾丸细胞的生物学研究进展。

一、睾丸细胞的分化和发育

1．生精细胞的分化：生精细胞由原始生殖细胞（PGCs）分化而来［3－4］。关于人 PGCs分化发育的研究较少，报道显示：人胚第7～9周时很多生殖细胞已具有生殖母细胞（性原细胞，gonocyte）表型；18周时分化为前精原细胞（prespermatogonia）［5－6］；随着曲细精管的形成，早期散在于睾丸索中央或周边的生殖细胞逐渐移位于管壁上皮细胞基底部，24周后显示出精原细胞（spermatogonia）的特征［7］。对小鼠PGCs分化的研究显示：出生后第1天的小鼠睾丸，大多数PGCs仍在索中央，但部分PGCs迁向基膜，此时的生殖细胞可称为生殖母细胞；至出生后第6天，生殖细胞绝大部分迁移至基膜，分化形成原始A型精原细胞（primitive type A spermatogonia）；出生后第8天，生精上皮中可见到A型精原细胞（type A spermatogonia）和B型精原细胞（type B spermatogonia）；此后直至青春期时，精原细胞才分化形成精母细胞，经过减数分裂和分化变形，最终生成精子［8－9］。

2．支持细胞的分化：在PGCs发育分化的同时，来源于初级性索的支持细胞也逐渐分化形成，此时的细胞有不规则的细胞核和突出的核仁。在胎儿睾丸中，支持细胞占据生精上皮的大部分。但从人胚20周至32周，支持细胞与生殖细胞之比约从3∶1减少为2∶1。至新生儿期，仅有少数支持细胞，核呈三角形着色深，胞质内可见少许张力原纤维，仍不具备性成熟期支持细胞的典型结构［7，10］。此后直至青春期前，关于人支持细胞形态结构的研究很少。在小鼠，出生后第1天，支持细胞多为长椭圆形，核仁明显，核膜可见有异染色质附着；出生后第10天，支持细胞胞体向索中明显突出，核色浅不规则，明显可见核仁；大约在出生后第15天青春期开始时，曲细精管管腔开始形成，支持细胞呈现成熟期的典型结构［10］。

3．间质细胞的分化：分散在曲细精管之间的间充质细胞分化为间质细胞。在哺乳动物，间质细胞分为形态和生化特征不同的两个类群：胚胎间质细胞（FLCs）和成年间质细胞（ALCs）。人胚胎期，其间质细胞前体（分化前型）在孕6～7周开始功能激活；孕7周以后间质细胞逐渐增殖分化，胞质中滑面内质网和线粒体开始增加，粗面内质网减少；孕19周后间质细胞变性退化。研究显示：人胚7～14周，间质细胞处于分化阶段，细胞发育为分化型；14～18周，间质细胞处于成熟发育阶段，细胞转化为成熟型，具有旺盛的合成分泌雄激素能力，形成胚胎时期雄激素的分泌高峰；人胚13～16周时，间质细胞数量最多，占睾丸体积一半以上［11－12］。ALCs不是来源于已有的FLCs，而可能来源于未分化的管周样干细胞（Leydig干细胞）。在大鼠的研究显示，Leydig干细胞出生后开始增殖，出生后14d转化为纺锤形的前体Leydig细胞；前体细胞短暂存在于14～28d间，在这个时期细胞逐渐增殖转化为未成熟Leydig细胞，胞质中含有大量脂滴；未成熟Leydig细胞经过1～2次分裂及进一步分化，出生后56d形成成熟的ALCs，胞质中脂滴减少，黄体生成素（LH）受体增多［13］。

二、生精细胞的细胞生物学

1．精原细胞：精原细胞位于生精上皮基膜。对大鼠和小鼠精原细胞的研究较多，其细胞类型和生化表型与人精原细胞有所不同。小鼠精原细胞分为A型精原细胞，中间型精原细胞（intermediat spermatogonia）和B型精原细胞；A型精原细胞又分为未分化和分化型两大类。未分化A型精原细胞包括 A-single（As）、A-pair（Apr）和 A-aligned（Aal）细胞，As是单个存在的精原细胞，分裂增殖产生2个通过胞质桥相连的Apr细胞，Apr细胞进一步分裂形成4、8、16个成链状排列的Aal细胞。这些未分化精原细胞（主要是Aal细胞）进而增殖分化生成A1、A2、A3、A4细胞，它们属于分化的A型精原细胞。分化的A型精原细胞分裂分化生成中间型精原细胞、B型精原细胞［14］。早先的研究中，一般将未分化的A型精原细胞认为是小鼠的精原干细胞（SSCs），现在研究表明只有As细胞是SSCs，并且可能并不是所有As细胞均具有干细胞特征［14－15］。

哺乳动物的精子发生是经典的干细胞依赖过程，SSCs经自我增殖和分化最终形成精子。因此，研究SSCs增殖和分化的机制已成为生殖领域的重要课题，是深入揭示精子发生机制和诊治雄性不育的重要途径。借助基因敲除、精原细胞移植技术、SSCs体外培养等研究平台，国内外对小鼠SSCs增殖分化机制的研究已取得一定进展，证实了一系列生长因子（如 GDNF、FGF2）、信号通路（如PI3KAkt通路、MEK 通路）、转录因子（如 Plzf、Etv5、Bcl6b）、MicroRNAs（miRs）以及细胞所处微环境（如黏附分子、干细胞龛）在其中的作用［14－16］，但完整的调控网络尚未完全阐明。值得注意的是，已有研究显示小鼠和人的精原干细胞有不同的表面标记物［17］，它们分化为精母细胞的分子机理可能也存在着差异。

2．初级精母细胞：由B型精原细胞分裂形成的初级精母细胞处于分裂间期，称细线前期精母细胞，其结构特点与B型精原细胞相似。间期的初级精母细胞停留时间很短，立即进入分裂期，此时的初级精母细胞内细胞器增多，高尔基复合体发达，线粒体逐渐变成泡状线粒体，胞质密度高于精原细胞。由于分裂前期较长，达22d，所以在切片上可以看到大量处于分裂前期各阶段的初级精母细胞，根据它们的细胞核和染色体形态特征不同，可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期［1－2，18］。

初级精母细胞是启动减数分裂的时期，这是配子发生的第一个关键步骤，阐明其调控机制是生殖生物学研究的核心内容。在哺乳动物中，减数分裂启动机制的研究大多在胚胎期进行，研究显示减数分裂启动需要内在与外在两方面条件：外源条件主要是视黄酸（RA）降解酶CYP26b1介导的水平；内在条件为原始生殖细胞在特定时期表达DAZL蛋白，从而使细胞具备响应RA的能力，保证了Stra8、Dmc1、Scp3等减数分裂相关基因的正常表达［19］。在雌性小鼠胚胎卵巢内，CYP26b1的水平低下，保证高水平的RA作用于生殖细胞，诱导Stra8表达而启动减数分裂。而雄性小鼠胚胎睾丸中CYP26b1高表达，RA水平低下，抑制Stra8表达，使生殖细胞阻滞于有丝分裂G0／G1期；至出生后青春期，睾丸中Stra8表达，启动减数分裂［20］。然而，近来有研究显示Stra8的表达不依赖CYP26b1介导的RA水平［21］，RA在减数分裂起始过程中的作用受到质疑。因此，减数分裂的启动受哪些因子调控以及如何调控，仍是迫切需要解决的问题。

3．次级精母细胞：初级精母细胞完成第一次减数分裂，形成两个体积较小的次级精母细胞（secondary spermatocyte）。次级精母细胞更靠近管腔，具有均质状的圆形核，染色质呈细网状，并有一些大而深染的环形块［1－2］。次级精母细胞存在的时期短，在组织切片中不易见到。

4．精子细胞：次级精母细胞完成第二次减数分裂，形成精子细胞（spermatid）。根据精子细胞发育的成熟程度及形态学特点，可分为圆形精子细胞（round spermatid，RS）和长形精子细胞（elongated spermatid，ES）。精子细胞经核的浓缩和核蛋白转型、顶体形成、尾部形成、多余胞质的丢失等一系列复杂而有序的过程，转变为精子（spermatozoon），称为精子变形（spermiogenesis）。由于单倍体细胞的特殊性，对于精子变形的研究，以往主要借助于亚细胞结构观察、超微结构观察、免疫细胞化学等形态学手段，研究显示一些特异的亚细胞结构可能参与精子变形的各种生物学事件。如高尔基体分泌产生的囊泡参与顶体形成，随着精子细胞核的浓缩变长，高尔基体不断产生囊泡与之融合，呈扁平状覆盖在细胞核表面，逐渐包绕精子细胞核的大半部形成顶体［22］；顶浆复合物位于精子顶体与核之间，能稳定顶体并将其锚定在精子核上，同时作为骨架提供一定的机械应力来调节外力对核的拉伸作用［23］；精子颈带是正在变形的长形精子细胞特有的一种微管结构，一方面它与顶体、顶浆一起形成顶体－顶浆－颈带复合物，参与核的浓缩与变形，此外还参与精子尾部以及残余体的形成［24］。近年来，随着基因敲除以及各种高通量技术的应用，逐渐在分子水平揭示精子变形的机制，特异的基因／蛋白质及其之间的相互作用被证实参与精子变形的各个生物学事件［25］。

5．精子：人类精子是男性生殖细胞系发育的终端产物，它最终通过与卵细胞融合完成受精，将父辈的遗传信息传递给后代。在附睾分泌蛋白的作用下，大量的精子功能蛋白发生修饰加工，如磷酸化、糖基化、酯化、酰化、羧基化，使精子逐步获得各项功能［26］。目前对精子功能的研究，除揭示精子特异基因的表达种类、时空和表达量变化外，其蛋白本身的修饰及调控也是非常重要的内容。事实上，精子特殊功能发挥的背后存在着非常复杂的调控网络，绝不是一个或几个基因／蛋白所能控制。近年来，高通量的转录组以及蛋白质组学技术已应用于精子功能及其调控的研究［26－28］，这为全面揭示精子功能提供了基础。

三、支持细胞的细胞生物学

1．支持细胞（Sertoli细胞）形态结构：成熟型支持细胞形状复杂，在光镜下甚至不能看清楚其细胞轮廓，近年的电镜研究有一些新进展。支持细胞基部紧贴基膜，顶部伸达管腔，侧面和腔面伸出许多不规则突起，包围着各级生精细胞。支持细胞核大，核表面有一至数个较深的凹陷，核孔多，核质均质状，异染色质稀疏，核仁发达［2，29］。支持细胞胞质的电子密度较高，含有各种细胞器：（1）大量细长形的线粒体，基质致密。（2）发达的高尔基复合体，位于核附近，由平行的池及小囊泡组成。（3）呈管状的粗面内质网，主要分布在细胞基部。（4）细胞基部的滑面内质网常聚集在脂滴周围，形成同心圆状结构；在围绕精子头的细胞顶部胞质中，滑面内质网平行排列，形成表面小池，可能与精子的排放有关。（5）溶酶体系统的组成成分多样化，与支持细胞降解和处理精子残余胞质的功能相关。（6）含微丝和微管成分，它们是支持细胞的骨架，是细胞形状主动改变的基础，保证生精细胞在生精上皮中逐步上升以及精子的排放；其中，在细胞顶部凹陷深处的平行微丝束，是在精子细胞核浓缩的过程中形成的，可能是维持精子细胞附着于支持细胞的一种特殊装置［2，29］。除各种细胞器外，在支持细胞顶端胞质中常可见精子残余体；基部胞质中则含有脂滴、糖原等内含物，脂滴的含量和支持细胞的功能状态有关，在精子排放后其含量增多，可能是从吞噬的残余体转化而来，随后脂滴逐渐减少［2，29］。

2．支持细胞的连接结构：相邻支持细胞以及支持细胞－生精细胞接触面的连接结构，是支持细胞行使功能的重要结构基础，主要分为三类：紧密连接（tight junction，TJ）、锚定连接（anchoring junction）和缝隙连接（gap junction，GJ）［30］。紧密连接是相邻支持细胞基部细胞膜间形成的连接结构，电镜下呈点状、斑状或带状，由闭锁蛋白（occludins）、紧密连接蛋白（claudins）、连接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）等构成，迄今报道的紧密连接相关蛋白已有100多种，这些蛋白在细胞间连接和细胞能动性方面发挥重要作用［30－31］。支持细胞间形成的紧密连接是血－睾屏障（blood-testis barrier，BTB）的主要组成部分，将生精上皮分隔成基底室（basal compartment）和近腔室（adluminal compartment），基底室有精原细胞和细线前期精母细胞，近腔室有较晚期初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子［30－31］。近年来研究发现，精子发生过程中支持细胞紧密连接的重建可能直接或间接地与生殖细胞发育过程及生殖细胞穿过BTB有密切联系。因此，研究紧密连接的重建对今后探索精子发生机制有极为重要的意义。锚定连接包括黏附连接（adheren junction，AJ）、细 胞 外 质 特 化 （ectoplasmic specialization，ES）、管状复合物（tubulobulbar complex，TBC）、桥粒以及半桥粒五种连接结构，参与组成BTB［30］。缝隙连接由相邻细胞膜上的GJ蛋白半通道对接形成，是支持细胞间以及支持细胞－生精细胞间的化学信号通道，参与异质细胞间的电子代谢作用，使相邻细胞活动同步，对精子发生过程中的同期化现象具有重要作用［32］。

3．BTB：存在于曲细精管与睾丸间质的血管之间，由以下几部分组成：（1）毛细血管内皮及基膜；（2）间质的结缔组织；（3）生精上皮基膜；（4）支持细胞间的连接结构。BTB中的细胞连接可有多种不同的连接方式，包括TJ、基底TBC、基底ES、桥粒和缝隙连接。其中，具有周期性重建作用的TJ是构成BTB最为重要的组成成分，对血液中各种物质的通透性选择性很强，是屏障中最不易通过的结构，而BTB的有序开放是精子生成的保证［30，33］。BTB的一个重要功能是形成并维持有利于精子发生的微环境；另一方面，BTB还是一道有效的免疫屏障，使精母细胞和精子抗原不能与体内的免疫系统接触，因而可避免生精细胞自身免疫反应发生。

四、间质细胞的细胞生物学

出生后，ALCs逐渐开始增殖分化，青春期后分化为成熟的ALCs。成熟ALCs呈多角形或球形，直径约为15～20μm；核圆居中；胞质嗜酸性强，含丰富的滑面内质网、管状嵴线粒体和脂滴［1－2］。间质细胞的主要功能是合成和分泌雄激素。胞质中的滑面内质网含丰富的胆固醇酯酶，能催化由血中摄取的脂肪酸和胆固醇形成酯化胆固醇并储存在脂滴中。脂滴周围含有可溶性酯酶，可催化脂滴中的胆固醇酯释放出游离的胆固醇作为合成类固醇的原料。合成雄激素功能活跃的Leydig细胞利用脂滴中的物质比较快，脂滴减少，体积变小；反之，合成雄激素功能不活跃的间质细胞，脂滴多，体积也大。因此脂滴的多少，在一定程度上可作为衡量间质细胞功能的一个形态学指标。脂滴释放的胆固醇快速转运至线粒体内膜，经线粒体酶的作用转化为孕烯醇酮，此后在滑面内质网酶的作用下再转化为睾酮。成年期时睾酮分泌稳定，以维持精子发生、男性第二性征和性功能；睾酮还能促进蛋白质合成、骨骺融合，并刺激骨髓造血，此外对机体免疫功能也有调节作用［1－2］。近年研究显示，间质细胞还能合成和分泌多种生长因子和生物活性物质，参与睾丸功能及骨代谢的调节［34］。

近年来，借助于核磁共振、透射电镜、免疫电镜、激光共聚焦显微镜等先进仪器和技术，睾丸细胞生物学领域的研究仍大有可为，如支持细胞的构象、支持细胞与生精细胞的连接结构、精子发生和精子形成。此外，高通量技术在男性生殖研究中的应用，将有助于全面、深入地在分子水平理解精子发生和精子功能的生物学过程及调控。

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