高分辨率熔解曲线分析技术检测EGFR基因突变方法的建立及其初步临床应用

王 卓，井昶雯，曹海霞，马 蓉，吴建中

肺癌是导致死亡的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌占肺癌的75 %～85 %，近年来表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR) 突变与肿瘤发生以及在非小细胞肺癌分子靶向治疗中的作用日益受到人们的关注。EGFR 突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TK)区域的前四个外显子上(18～21)。EGFR 突变是癌症患者是否对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)敏感的强预测因子[1]，因此，EGFR 基因突变的检测能为肿瘤靶向治疗提供重要依据。本研究拟采用高分辨率熔解曲线(high resolution melting，HRM)分析技术建立EGFR 基因突变的检测方法，检测EGFR 基因18～21外显子的突变，将其应用于临床标本的检测，并评价其临床应用价值 。

1 材料和方法

1.1 标本

2010年1月至2012年12月，我院收治的非小细胞肺癌患者肿瘤石蜡包埋组织200例。用DNA FFPE tissue kit (Qiagen)提取试剂盒提取石蜡组织DNA，并保存于-20 ℃备用。

1.2 实验方法

1.2.1 设计适用于HRM技术的引物[2]，引物如表1所示。

表1 HRM法引物

1.2.2 HRM反应体系与反应条件

HRM检测采用Roche Light Cycler 480 system。反应体系为Light Cycler HRM Master Reaction Mix,3 mM MgCl2, and 200 nM primers和DNA模板，总体积为20 μl。扩增反应条件为：95 ℃预变性10 min，然后95 ℃变性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环(采用touchdown技术，前10个循环退火温度从65 ℃降到55 ℃，每个循环降1 ℃)。扩增结束后直接进行HRM分析，反应条件为95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲线数据收集从70 ℃到95 ℃，温度上升速率为1 ℃/s。40 ℃冷却。

1.2.3 所有实验检测标本HRM法检测结果均与金标准测序法检测结果进行对比分析。分析其特异性和敏感性。测序法引物如表2所示。

表2 测序法引物

1.2.4 HRM检测体系的重复性

取经测序法验证的野生型和突变型标本各1份，进行HRM检测。每份标本检测重复3次，计算不同基因型标本的Tm 与ct值的CV值。

2 结果

2.1 测序法和HRM法EGFR基因突变结果统计与分析

测序法检测结果显示，EGFR基因18～21外显子突变总检出率为37.0%，18～21外显子突变检出例数分别为2，35，2和37例，其中有2例双突变，均为19，21外显子双突变。HRM法检测结果，EGFR基因18～21外显子突变总检出率为40.0%，18～21外显子突变检出例数分别为2，39，3和38例，其中有2例双突变，均为19，21外显子双突变，突变样本与测序法检出结果一致。HRM法突变检出率略高于测序法。具体结果如表3所示。

表3 测序法和HRM法EGFR基因突变统计结果

图1为实验中选取的HRM法与测序法典型突变示意图。左侧从上到下依次为HRM法检测18，19，20和21外显子的突变示意图，右侧从上到下依次为测序法18外显子G2156C点突变，19外显子缺失突变，20外显子插入突变，21外显子C2573和T2573G突变示意图。

图1 HRM法与测序法典型突变示意图

2.2 HRM法特异性和敏感性

HRM法与测序法相比，敏感性与特异性结果如表4所示。HRM法与测序法相比，敏感性为100%，特异性为>95%。其敏感性和特异性符合临床检测的要求。

表4 HRM法特异性和敏感性

2.3 重复性评价

野生型和突变型标本经HRM方法检测后，其Tm的CV值分别为0.02%和0.03%。ct值的CV值分别为1.82%和1.56%。CV值均较小，可见该方法重复性好，稳定性高。

3 讨论

表皮生长因子受体是一种跨膜蛋白，它的结构主要有3个部分：细胞内的酪氨酸激酶域、跨膜区以及细胞外的配体结合域。其主要分布在细胞膜的表面[3]，属于HER家族的一员。研究表明其主要作用机制使其是通过与胞外配体的结合，然后进行同源二聚化或异源二聚化，使得胞内酪氨酸残基磷酸化，活化的受体募集信号复合体并同时活化下游的信号转导蛋白，从而调节肿瘤细胞的生长、侵袭、转化、血管生成以及转移[4-6]。大量资料表明EGFR基因是肺癌生长相关的重要调控基因[5-6]。EGFR突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上(18～21)，他们能导致不依赖于配体的EGFR TK激活。EGFR突变是癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子[1],因此，EGFR基因突变的检测能为肿瘤尤其是非小细胞肺癌患者靶向治疗提供重要依据。

目前临床上进行EGFR基因突变的检测多采用测序法和ARMS法。测序法过程较复杂繁琐、耗时长，且该方法对取材和操作技术的要求比较高，此外由于测序方法本身的限制灵敏度不高，原则上只能对含量大于30%的突变基因进行检测，致使很多标本的检测受限。ARMS法方便、灵敏，但价格昂贵，且只能检测已知突变，无法检测未知突变。因此，寻找并建立新的EGFR基因突变的临床检测方法显得极为重要。

HRM法的原理是在扩增含有突变位点的基因的过程中,由于基因突变位点的不匹配会导致在升温过程中其双链DNA率先解开,从而使得荧光染料从局部解链的DNA分子上释放出来，因此，从时间曲线和荧光强度上就可以判别出是否存在突变位点[7-10]。虽然HRM法无法像测序法那样准确检测出具体突变类型，但是不同基因突变的位点、纯合子还是杂合子等因素都会影响熔解曲线的峰形，因此，HRM检测分析能够区分出不同的基因类型和不同基因突变的位点[10]。文献报道，HRM法检测突变的灵敏度达到5%[2]，与测序法相比灵敏很多，因此HRM法突变检出率理论上应高于测序法。本文的研究结果也显示HRM法突变检出率略高于测序法。但高出的突变检出率是由于检测灵敏度的提高，还是因检测中存在假阳性，仍需进一步验证，尤其是临床疗效的观察验证。

总之，本文的初步研究可以看出，HRM法与测序法和ARMS法相比较，具高通量，敏感性和特异性好，重复性好，不受突变碱基位点与类型局限，可以检测未知突变，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行HRM分析，操作简便，节约时间，成本低，适合应用于临床检测EGFR基因突变。

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