noxs基因：病原菌菌膜形成及毒力调控的潜在靶点

陈国薇，张 超，董庆利，吴淑燕，刘 箐*

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

noxs基因：病原菌菌膜形成及毒力调控的潜在靶点

陈国薇，张 超，董庆利，吴淑燕，刘 箐*

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

noxs基因介导产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是动植物细胞中普遍存在的“胁迫应答信号分子”。有研究表明细菌中也存在类似的noxs基因，当病原细菌面临不良生存环境时，该基因被激活并通过产生ROS来调控菌膜形成和细菌毒力因子，本文对noxs基因及其介导产生的ROS在此过程中的作用予以综述。

noxs基因；菌膜形成；毒力调控

细菌菌膜（bacterial biofilm，BF）是多数细菌在感受到不良生存环境后，就近聚集黏附于固相载体，并分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等将其包绕其中形成空间立体结构，用于抵抗不良环境的细菌聚集膜样物，作为一种细菌的“抗逆生存状态”，BF具有应对不利生存环境、逃避免疫细胞吞噬、对抗抗生素等抗逆功能，是细菌扩散、抗药性产生的重要原因之一[1-2]。值得关注的是胁迫环境下，具有较好形成BF能力的细菌，在环境胁迫解除后，BF释放的浮游菌，因经过“恶劣环境”筛选，表现出更强的抗药性和致病力[3]。在食品中，形成BF是食源性致病菌在加工、运输、储存环节，应对杀菌剂、射线、高温、冷冻等胁迫的“生存策略”，处于BF状态的食源性致病菌随食品或运输工具蔓延传播，不仅提高了致病菌传播风险，而且由于BF的“包裹”导致致病菌漏检，对食源性致病菌检测及风险评估的准确性带来影响；在临床医学，致病菌因形成BF逃逸免疫细胞识别及产生抗药性，形成久治不愈甚至伴随终身的“菌膜病”，如绿脓杆菌、克雷伯肺炎杆菌引起的慢性呼吸道感染，金黄色葡萄球菌引起的骨髓炎等慢性疾病；另外，人体各种感染性结石、蛀牙，也是因为BF形成后表面沉积草酸钙而成，体内人工置留物如起博器、人工瓣膜、支架等表面的BF，会直接影响器械寿命[4]。

细菌BF形成，是“环境胁迫-存活细菌BF形成-细菌生存”这样一个周而复始的自然选择过程。近年来环境污染、抗生素滥用等“细菌生存环境”的日益恶化，大大加快了这一自然选择的进程。BF形成的生物学本质是“信号感应-基因调控-蛋白表达-菌膜形成”这样一个连续的生物学事件，因此从BF形成分子机理入手，探讨BF形成过程的“关键控制点”成为BF研究的重要方向。以“bacterial biofilm”为关键词，在PubMed共搜索到12 058篇文献，其中2010～2013年4 a文献多达4 802篇，占1981年BF正式被报道以来全部文献的40%（2013年2月27日检索），进一步文献分析发现，近年有关细菌BF的研究，大量集中在BF形成机制、毒力相关基因表达调控，及以BF为靶点的新型抗生素研制等方面。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NAD(P)H oxidase）是动植物细胞中专门产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）最重要的酶之一，该酶由gp91phox、p22phox、p40phox、p47phox和p67phox5个亚基组成，其中gp91phox是NAD(P)H氧化酶的关键亚基，共有7种亚型（NOXs），分别由7个基因nox1、nox2、nox3、nox4、nox5、duox1、duox2（统称noxs）编码，在不同细胞中，甚至在同一细胞的不同亚细胞结构所表达的NOXs亚型有所不同。noxs的共同特点是：对多种环境胁迫敏感并可被瞬时激活，由其介导产生的ROS参与多种细胞信号转导及基因表达调控。人体细胞在环境胁迫如重金属[5]、射线[6]等刺激下noxs可被激活，由NAD(P)H供给O2电子生成超氧阴离子自由基（O2－·）或过氧化基团（O22－），其反应式为O2＋e→O2－·，O2＋2e→O22－，O22－又可以和H+发生反应生成另外一种活性氧H2O2，其反应式为O22－＋2H+→H2O2，然后O2－·和H2O2发生反应生成羟自由基（·OH），其反应式为O2－·＋H2O2＋H+→O2＋H2O＋·OH。既然动植物细胞在面临环境胁迫下，noxs可被瞬时激活产生“信号分子”ROS，那么细菌是否也存在类似的ROS产生机制？细菌中的noxs和BF形成及毒力调控，有何关联？本文就此问题，予以分析综述。

1 ROS与细菌菌膜形成、毒力基因调控密切相关

以“bacterial 、biofilm、virulence、reactive、oxygen、species”为组合关键词在PubMed共搜索到文献35篇（2013年2月27日检索），关联文献分析发现， 多种环境胁迫均伴随着ROS的产生、ROS调控细菌BF形成及毒力相关基因表达，且表现出“信号分子”的特性。

1.1 环境胁迫诱导病原菌产生ROS

2004年Albesa等[7]报道，大部分抗生素在作用于细菌时会伴随ROS产生，“抗生素胁迫”筛选的细菌基因突变可能是抗药性产生的重要机理；Boles[8]、Rodrigues[9]等进一步验证了这一观点，在抗生素作用下，绿脓杆菌形成BF，BF中过量的ROS氧化损伤DNA，细菌自我修复过程中，部分基因突变菌株得以存活，这些突变菌株抗药性增强；另外，其他环境胁迫如温度、水分、营养、离子强度、过氧化氢等，也会诱导细菌产生ROS进而调控BF的形成及毒力，如2012年，Kulkami等[10]研究显示，吸烟可诱导呼吸道感染病灶中的金黄色葡萄球菌ROS的升高，同时上调BF形成相关基因sarA、rbf的表达；2005年Berlutti等[11]的研究显示，铜绿假单胞菌、克霍尔德氏菌中过量Fe3+诱导产生的ROS和细菌聚集、BF形成、细菌黏附、侵袭能力有关。从这些研究推测，环境胁迫诱导细菌产生ROS可能具有一定普遍性，ROS直接和BF的形成及毒力调控相关，虽然缺乏直接、有力的证据，但是ROS对最古老生物——细菌生存的调节作用，值得深入探究。

1.2 ROS调控BF形成及毒力相关基因

环境胁迫下细菌中ROS产生的普遍性，引起了研究者对ROS对细菌BF形成及毒力基因调控的兴趣。2012年Priyanka等[12]用基因微阵列技术研究发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，Bs）中有200个对环境胁迫应答基因；其中有94个受控于抗逆关键调控因子σB基因，在乙醇、NaCl、4℃、12.5℃、54℃、H2O2、百草枯（除草剂）等环境胁迫下基因表达上调，与此同时Bs内ROS升高；同年Reder等[13]对这94种基因进行基因敲除筛选突变株，用ROS产生激发剂百草枯和H2O2刺激Bs后发现（H2O2本身是一种ROS，在人体细胞中可激活noxs基因产生ROS），有62种基因敲除突变株内源性ROS产生明显下降，其中包括部分菌膜形成相关基因。这一系列研究提示环境胁迫下，Bs中有多种基因和ROS的产生有关；另外，ROS还被证实直接调控细菌毒力关键基因prfA的表达，Makino等[14]研究表明，H2O2可大幅度上调单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)的prfA、hly基因表达，prfA编码的PrfA（positive regulatory factor A），是调控绝大多数毒力基因转录表达的重要蛋白因子，hly编码的李斯特菌溶血素（Listeriolysin O，LLO）是一种依赖胆固醇的孔形成毒素，无LLO的Δhly-Lm 不能进入宿主细胞质。由此推测，ROS不仅和BF形成、毒力调控关键因子有关，而且对一些未知基因有潜在影响；在ROS与BF形成、毒力调控因子研究方面，近年也有少量报道，2012年Lebreton 等[15]在屎肠球菌中发现，ROS可调控胁迫反应调节因子AsrR（antibiotic and stress response regulator），该调节因子属于多药耐药基因MarR家族，在感受到H2O2氧化胁迫后，AsrR中的半胱氨酸氧化，促使其从启动子上分离；2013年Liu Xing[16]等，在表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，Se）中发现一个新的聚集和菌膜形成调节因子AbfR（aggregation and biofilm formation regulator），该因子可被ROS激活，AbfR缺失Se突变株中氧化信号感受能力减弱。

从以上零星研究推测，细菌中可能存在复杂的ROS感应、信号传递、调控反应体系，但可惜的是，诸多关于细菌BF形成、毒力调控过程中，将noxs作为靶点的研究，和动植物细胞相比，仍然是滞后至少10 a以上。

1.3 ROS是BF形成及毒力调控可能的“信号分子”

“群体感应系统”是细菌种群内部或者不同种群之间的信息传递体系，lasR是细菌中群体感应系统的关键基因，2010年Cugini等[17]的研究初步证实ROS的“信号分子”作用，在lasR基因缺失的的铜绿假单胞菌突变株中，外源H2O2可弥补lasR功能缺失，恢复ΔlasR突变体中的群体感应和BF形成能力；2012年Suo Yujuan等[18]为ROS调控BF形成提供了新的证据，在超氧化物歧化酶（主要清除细胞中的O2－·）缺失的Lm细胞株Δsod-Lm中，BF的形成显著降低，同时Δsod-Lm中的ROS升高，另外抗氧化酶基因cat（编码细胞内重要的清除H2O2的CAT酶）、胁迫应答基因perR和sigmaB、DNA修复基因recA，在Δsod-Lm中表达降低 ；同年Tang Yulong[19]在猪链球菌（Streptococcus suis，type 2，SS2 ）中证明了类似的观点，同时还证明sod缺失的SS2菌株，对老鼠的毒力明显降低。

这些研究提示：胁迫环境下产生内源性ROS可能是细菌一种“应答机制”，具有和动植物细胞中ROS一样的“信号分子”功能，那么细菌中的ROS从何而来？是否和高等动植物细胞一样，拥有专门产生ROS的酶？

2 noxs基因是逆境胁迫下细菌ROS的潜在重要来源

以“Bacterial、nox”为关键词在PubMed上检索到168篇文献（2013年2月27日检索），其中大部分文献报道细菌毒素对人体细胞noxs的激活，仅有数十篇文献证实：细菌中确实存在专门产生ROS的noxs基因。目前已经在19种细菌中报道了noxs基因[20]，根据所产生ROS种类和功能的不同，将noxs分为3种。第1种是需氧细菌中专门产生H2O2的nox1（H2O2-forming NADH Oxidase）[21]；第2种是厌氧菌专门产生H2O的nox2（H2O-forming NADH Oxidase）[22]，第3种是专门产生超氧阴离子（O2－·）的nox3（O2－·forming NADH Oxidase）[23]。这3种noxs的活性均需要氧的参与，且多以NADH为电子供体，但也有研究发现硫磺矿硫化叶菌的电子供体为NADPH[24]。

链球菌、乳酸菌中noxs研究较为集中，1985年Koike等[25]首次从肠膜明串珠菌发现Noxs活性，提取Noxs蛋白后以NADH、NADPH作为底物进行体外实验，发现Noxs蛋白可利用O2生成H2O2；1999年Auzat等[26]发现敲除肺炎双球菌（Streptococcus pneumoniae，Sp）nox1基因后，Sp对BALB/c小鼠致死率下降；2001年Yu等[27]敲除Sp的nox1后发现，Sp对长爪沙鼠的呼吸道感染力下降105CFU/mL，中耳炎致病力下降104CFU/mL；更有趣的是，2006年Yamamoto等[28]敲除B型链球菌nox2以后发现细菌侵染力下降，而之前的研究均认为细菌中nox2的主要功能是厌氧细菌拮抗氧化胁迫；另外，口腔致龋菌变异链球菌（Streptococcus mutans，Sm）的noxs也有较多研究，Ahn[29]、Derr[30]等研究发现，Sm在有氧培养条件下，其BF形成受阻，转录分析表明5%的基因表达异常，其中noxs表达上调；2012年Čáp等[31]通过对细菌noxs研究综合分析后，首次提出noxs介导产生的ROS可能是细菌一种重要的信号分子的观点。

综上所述，虽然早在1986年，Schmidt等[22]就报道了细菌中的noxs，后续也有证据表明细菌在胁迫环境下产生ROS并参与基因表达调控，但在动植物细胞中，noxs仅仅编码是NADPH oxidase的一个亚基，病原细菌中是否存在类似于动植物细胞的NADPH oxidase的多个亚基？其产生ROS的机理是否相似？由其介导产生的ROS是否是胁迫环境下病原细菌ROS的重要来源？noxs介导产生的ROS如何参与BF形成、毒力基因调控？以及noxs在细菌中的定位、功能等问题，目前并无深入的研究，以专门产生ROS的noxs基因为研究靶点，从ROS产生的根源来探讨致病菌BF形成、毒力调控的分子机制，将可能为致病菌致病机理、抗药性关键靶点筛选等问题的解决提供理论支持。

作为重要的病原微生物，是食品科学领域食源性致病菌以菌膜形式，黏附在食品加工的传送带、管道等部位，造成食品中致病菌的扩散和传播，是最常见、最容易被忽视的食源性致病菌污染源，2013年8月发生的新西兰奶粉肉毒杆菌污染事件中，最终的鉴定确定污染源来源于1根受污染的管道，虽然没有进一步的技术报告，但根据大多数细菌容易以菌膜形式传播污染的特性，有理由相信，此污染可能与肉毒杆菌菌膜形成相关，遗憾的是，国内外食品行业对菌膜的认识较少，有关菌膜与食品微生物污染所具有的密切的、直接的关系，尚需要基础研究和应用研究的共同推进。

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noxs Genes：A Potential Target for Biofilm Formation and Virulence Regulation of Pathogens

CHEN Guo-wei, ZHANG Chao, DONG Qing-li, WU Shu-yan, LIU Qing*
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

noxs Genes, which can mediate the generation of reactive oxygen species (ROS), are the “stress response signaling molecules” which exist widely in animal and plant cells. Studies have shown that similar noxs genes are also present in bacteria. When pathogenic bacteria face unfavorable living environmental conditions, these genes are activated and then regulate the biofilm formation and bacterial virulence factors by mediating the generation of ROS. This paper reviews the noxs genes in bacteria and their roles in mediating ROS generation in those processes.

noxs gene; biofilm formation; virulence regulation

Q932

A

1002-6630（2014）03-0234-04

10.7506/spkx1002-6630-201403047

2013-07-28

国家自然科学基金项目（31371776；31271896）

陈国薇（1989—），女，硕士研究生，主要从事食源性致病菌致病机理研究。E-mail：vickey5895@126.com

*通信作者：刘箐（1970—），男，教授，博士，主要从事食源性致病菌致病机理、快速检测研究。E-mail：liuq@usst.edu.cn