α-乙酰乳酸脱羧酶克隆表达方法

贺艳，张裕君，赵天来，赵卫东，郑文杰，史光华，赵璟源，刘跃庭，刘伟，张霞

（1.天津出入境检验检疫局，天津300461；2.中国合格评定国家认可中心，北京100062）

α-乙酰乳酸脱羧酶克隆表达方法

贺艳1，张裕君1，赵天来1，赵卫东1，郑文杰1，史光华2，赵璟源1，刘跃庭1，刘伟1，张霞1

（1.天津出入境检验检疫局，天津300461；2.中国合格评定国家认可中心，北京100062）

双乙酰是啤酒生产工艺中重要的风味物质，为控制啤酒生产中双乙酰的含量，缩短啤酒熟化时间，基因工程技术改造啤酒酵母已应用得非常广泛。综述国内外基因工程技术克隆表达方法，介绍检测策略。

α-乙酰乳酸脱羧酶；克隆；检测

双乙酰是啤酒生产工艺中重要的风味物质，但如果双乙酰含量超过0.15 mg/L时就能产生令人不愉快的馊饭味，严重影响啤酒的品质。啤酒成熟的重要标准是双乙酰浓度在其口味阈值以下（0.02mg/L～0.10mg/L）。啤酒生产过程中产生的双乙酰来源复杂[1]，主要是啤酒代谢的产物α-乙酰乳酸经非酶氧化脱羧产生。α-乙酰乳酸是缬氨酸代谢的中间产物，原因是丙酮酸经乙酰乳酸合成酶形成α-乙酰乳酸，而催化α-乙酰乳酸还原成二羟基异戊酸的乙酰乳酸还原异构酶的效率非常低，使α-乙酰乳酸得到积累，α-乙酰乳酸分泌到胞外后，通过非酶氧化脱羧形成双乙酰，双乙酰可再进入酵母细胞被还原成乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）和2，3-丁二醇。另外，α-乙酰乳酸还可以在α-乙酰乳酸脱羧酶的催化下直接形成乙偶姻和2，3-丁二醇。这两种物质的口味阈值均较高，对啤酒风味的影响比双乙酰小得多。如果在成熟阶段α-乙酰乳酸不能被充分除去，在随后的啤酒包装、杀菌过程中会有较多的双乙酰形成。这样α-乙酰乳酸反而成了啤酒成熟的时间限制因素。所以在啤酒成熟过程中加入双乙酰还原酶并不能有效降低双乙酰，而α-乙酰乳酸脱羧酶却可以很好的达到这一目的。

在实际生产中，控制啤酒产品的双乙酰含量的重点主要放在发酵阶段，当啤酒酿造过程进入储存阶段后，双乙酰的还原速度减慢，特别是进入低温阶段以后，双乙酰含量几乎没有什么变化。因此，在啤酒酿造进入低温阶段以前尽可能地降低双乙酰的含量十分重要。因此，若将该酶制剂应用于啤酒生产，在啤酒发酵阶段或后熟阶段加入。则可大大缩短啤酒后熟期，提高设备利用率和节省能源，产生极大的经济效益。

α-乙酰乳酸脱羧酶可将双乙酰的前体α-乙酰乳酸快速催化分解为乙酰姻，从而降低啤酒中残留的α-乙酰乳酸，防止成品酒中的双乙酰的反弹，同时可以使啤酒的成熟度大大提高。天然的啤酒酵母细胞中不存在合成α-乙酰乳酸脱羧酶的相关基因。Gostfredsen等[2]首先报导用ALDC可加速啤酒的熟化。

目前人们采用基因工程改造技术来降低啤酒中的双乙酰，其主要做法是在酵母菌中表达编码α-乙酰乳酸脱羧酶基因或者在啤酒生产中加入α-乙酰乳酸脱羧酶制剂。本文综述了利用基因工程技术改造啤酒酵母使其合成α-乙酰乳酸脱羧酶（α-acetolactate decarboxylase，ALDC，EC.4.1.1.5）降低双乙酰的前体α-乙酰乳酸的含量从而达到降低啤酒中双乙酰含量的方法，并介绍其检测策略。

1 α-乙酰乳酸脱羧酶克隆表达

丹麦Carlsberg实验室的科学家Godtfredsen等在1982年率先开展α-乙酰乳酸脱羧酶的研究工作，产气肠杆菌1033菌株能够产生α-乙酰乳酸脱羧酶，通过纯化得到该酶纯品，并进行加速啤酒成熟的试验。将α-乙酰乳酸脱羧酶加入到新酿制的啤酒中，在10℃保温24 h，啤酒中的双乙酰含量大大降低，其含量在味阈值以下，啤酒的主要指标和感官性质与常规熟化三周的啤酒相同，啤酒的成熟期明显的缩短。此后，人们陆续发现多种可产生α-乙酰乳酸脱羧酶的微生物有产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、短芽孢杆菌（Bacillus brevis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、克雷伯氏土生菌（Klebsiella terrigena）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）等。

Diderichsen等[3]根据已知的部分氨基酸序列合成探针，PCR扩增获得短芽孢杆菌ATCC11301的α-乙酰乳酸脱羧酶，分别转化大肠杆菌和醋化醋杆菌，均获得了表达。大肠杆菌中ALDC的表达是在细胞内，其中30%位于周质空间。而在醋化醋杆菌中74%的活性在细胞外。

Garmyn等[4]用微孔板筛选法克隆到了酿酒球菌的α-乙酰乳酸脱羧酶，并获得了高于供体菌的酶活表达。序列分析表明，该基因位于乙酰乳酸合成酶基因的下游，这两个基因位于同一操纵元内，这一结构同醋化醋杆菌类似。

Sone等[5]以酵母自主复制型载体（YRp）为基础，用包含启动子为酵母乙醇脱氢酶I（ADH1），产气肠杆菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因的质粒转化淡啤酒酵母K1084并获得了高效表达，每毫克蛋白有2个～3个ALDC活力单位。

Fujii等[6-7]基于含有酵母核糖体DNA的酵母整合型质粒YIp5构建的质粒含有产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因、酵母乙醇脱氢酶（ADH1）启动子、组氨酸透性酶（HIP1）终止子、G418抗性基因及rDNA同源重组序列。将转化菌株在非选择培养条件下培养，分离出只保有α-乙酰乳酸脱羧酶表达盒而不含有不需要的载体序列的转化菌株，得到了删除标记的含有20个以上α-乙酰乳酸脱羧酶拷贝的重组菌株。

Yamano等[8-9]将木醋杆菌（Acetobacter aceti ssp. xylinum）的α-乙酰乳酸脱羧酶分别克隆到酵母游离质粒YEp和酵母整合质粒YIp中，用大致相同的策略得到了整合α-乙酰乳酸脱羧酶基因的酵母转化株，并获得了稳定高效表达。同时比较了不同的启动子对ALDC基因在啤酒酵母中表达所起的作用。实验表明含有磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子的ALDC基因表达水平比乙醇脱氢酶（ADH1）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GPD）均高。

Goelling等[10]构建的ALDC表达酵母菌株包括巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）α-乙酰乳酸脱羧酶基因，乙醇脱氢酶（ADH1）启动子。发酵试验结果显示，总双乙酰含量明显下降，其它发酵特征无明显变化。为了得到稳定表达ALDC且易于被公众接受的重组酵母菌株，Stahl等[11]去除了同α-乙酰乳酸脱羧酶基因相连的抗生素基因，通过同源重组将α-乙酰乳酸脱羧酶基因整合在酵母染色体上。

郭文洁等[12]用Bam HI和Eco RI双酶切质粒pCM1-1，回收CUP1启动子和铜抗性基因片段，然后再用这两种酶双酶切pBG4，回收ALDC基因的片段。整合型穿梭YIp5用BamHI酶切线性化，碱性磷酸酶处理，构建了质粒pCMA2-1，具有铜抗性基因的表达载体，用完整细胞转化法将表达载体转化啤酒生产酵母菌株，并实现了功能性表达。

李联正等[13]设计了α-乙酰乳酸脱羧酶基因的两组引物，ALDC全长的上游引物为：ggggtacccgtcaaggcatgaacgc，下游引物为：cgggatcccatcagaccacacctttac，上下游引物中分别加入了KpnI和Bam HI位点；ALDC结构基因的上游引物为：catgccatggaacgagaaagcaac，下游引物为：gaagatcttattcagggcttccttc，上下游引物中分别加入了NcoIBglII以枯草芽孢杆菌168为模版，PCR扩增获得ALDC基因。将该基因克隆到表达载体pQE60中，构建了pQE60-ALDC，其启动子为T5。经IPTG诱导能够高表达ALDC。对该酶进行了活力测定，结果显示工程菌产酶活力为0.11U/mL。

李联正等[14]设计了上游引物：ccgctcgagaaaagaaaacgagaaagcaacattc和下游引物cggaattcttattcagggcttccttc，分别引入了XhoI和Eco RI位点，PCR获得ALDC，ALDC基因和大肠杆菌-毕赤酵母穿梭载体pPIC9双酶切后连接，构建了重组质粒pPIC-ALDC。SacI线性化重组质粒DNA后电击转化毕赤酵母GS115。SDSPAGE分析可见到相对分子量约62 000的表达条带，经测定表达产物活力为0.03U/mL。

苟帮超等[15]根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列，在上游引物引入Eco RI，在下游引物引入Bam HI酶切位点，具体序列分别为，上游引物caggaattcatgatgcactcatctgcctggac，下游引物：gcggatccgcccactgacgtgactgtttc。退火温度为50℃，利用PCR方法从产气大肠杆菌（Enterobacter aerogenes）中克隆到0.8 kb的DNA片段，经DNA序列分析表明该DNA片段为ALDC基因，仅186位碱基a被c替代，密码子acc替代aca，替代后仍然是苏氨酸。将该片段插入到原核表达载体pBV220中，获得表达质粒pBVEDAD，转化大肠杆菌DH5α（Escherichia coli），经热诱导后，通过SDS-PAGE分析和酶活测定，结果表明ALDC获得了高效表达。

秦玉静等[16]用Bam HI部分酶切含α-乙酰脱羧酶基因的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis AS10106的染色体DNA，pUC19质粒也用BamHI酶切后转化大肠杆菌得到4 800个重组转化子，转化子中均含有4 kb～10 kb的外源插入DNA片段。筛选出含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的质粒后转化JM109，利用酵母穿梭质粒pYES2为载体，启动子为GAL1，可以将α-乙酰脱羧酶基因引入酿酒酵母中，从而使重组酵母菌株具有降解啤酒发酵中生成的α-乙酰乳酸，减少双乙酰含量的能力。

沈亮等[17]用PCR方法扩增乙酰短杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因（ALDC），得到0.78 kb的DNA片段。将回收到的ALDC基因用Bam HI和Eco RI双酶切后，重组到表达载体pQE-9中，在大肠杆菌JM109中得到高效表达，用IPTG，40℃诱导并进行SDS-PAGE，结果表明该基因已表达，表达量占总蛋白的40%。

王爱娥等[18]等根据已知α-乙酰脱羧酶的基因序列，设计了两条引物，在上游引物的5’端分别加上Bam HI和下游引物加入Eco RI的识别位点，上游引物gcagaattcatgcactcatctggcctgcgac，下游引物gcaggatccgcccactgacgtgactgtttc，用PCR法从产气肠杆菌（Ebterobacter aerogenes）中克隆到约0.8 kb的DNA片段，经DNA测序证明是ALDC基因，将该基因重组到相同酶切过的质粒pBV220中，转化大肠杆菌，实现了高表达，获得了目的蛋白表达量约50%的转化子。

廖东庆等[19]用P43启动子的引物，上游引物为attgctggacgcttatggac，下游引物为：cgggatccattcctctcttac，经过PCR扩增获得枯草芽孢杆菌启动子P43。将P43和质粒pUC19-ALDC同时用Bam HI和HindIII双酶切后，链接得到重组质粒pUC19-P43-ALDC，其中P43启动子和α-乙酰乳酸脱羧酶基因之前。由于pUC19-P43-ALDC与质粒pMLK83-BN有两段同源臂，因此通过同源双交换将ALDC插入到了amyB位点，筛选得到具有新霉性抗性且无淀粉酶活性的枯草芽孢杆菌的重组菌株。

张燎原等[20]运用生物信息学和PCR方法，设计的引物为上游引物：cgcggatccatgaacgaaaaacacgggt，下游引物为：cccaagcttagccctcgfcggaacgaat，上游引物加入Bam HI酶切位点，下游引物加入HindIII酶切位点，鉴定了粘质雷氏菌乙偶姻生物合成突进中编码α-乙酰脱羧酶序列。经测序和序列分析显示α-乙酰乳酸脱羧酶基因的开放阅读框（ORF）长度为780 bp，编码259个氨基酸，编码蛋白分子量和等电点氛围为28.96 kDa和5.48，属酸性蛋白。将基因用相应的限制性内切酶酶切后，克隆至pET28a（+）表达载体中，并转化E.coli BL21（DE3）。IPTG，30℃诱导表达，SDS-PAGE结果表明在大约29 kDa的位置出现了特异性蛋白条带，表明α-乙酰脱羧酶基因在E.coli BL21（DE3）中获得了高效的表达。

张沛等[21]用Bam HI/Eco RI和Eco RI/SacI酶切质粒pCM1-1，分别回收CUP1启动子片段和铜抗性片段（MTI），与Bam HI/Eco RI酶切质粒pBC4，回收约2 kb，含枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因，整合型穿梭载体YIp5经Bam HI酶切线性化，碱性磷酸酶处理。构建了重组质粒。转化子测定α-乙酰乳酸脱羧酶活性测定结果表明质粒能高效表达该酶。

2 检测策略

检测中用的方法通常包括结构特异性检测和品系特异性检测。基因工程技术涉及到的载体有大肠杆菌，酵母菌和醋化醋杆菌，而且克隆技术各不同，在筛查检测中可以选用结构特异性检测，针对α-乙酰乳酸脱羧酶基因设计特异的上下游引物及探针。而对于某种基因工程技术生产的酶制剂的检测，则可以选用品系特异性检测。同时考虑到酶制剂在加工过程中会有极端条件，则可以选用短片段100 bp至300 bp为检测目标。另外，检测方法的检测灵敏度需要低于0.02mg/L，这样才能有效地对酶制剂甚至是用酶制剂生产的啤酒进行有效监管。

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Cloning and Expression Methods of α-acetolactate Decarboxylase Gene and Detection Strategy

HE Yan1，ZHANG Yu-jun1，ZHAO Tian-lai1，ZHAO Wei-dong1，ZHENG Wen-jie1，SHI Guang-hua2，ZHAO Jing-yuan1，LIU Yue-ting1，LIU Wei1，ZHANG Xia1
（1.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quanrantine Bureau，Tianjin 300461，China；2.China National Accreditation Service for Conformity Assessment，Beijing100062，China）

Diacetyl is the important flavour in beer processing technique.In order to lower diacetyl concentration in beer production，shorten fermentation time of beer，gene modified technology is commonly used to introduce α-acetolactate decarboxylase gene into beer yeast strain.The different cloned methods and express methods were reviewed.The detection strategy was formed.

α-acetolactate decarboxylase；clone；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.036

2013-10-12

贺艳（1978—），女（汉），高级工程师，硕士，研究方向：植物保护。