结核分枝杆菌L型的诱导及其对抗菌药物的敏感性

张学丽，肖红侠，吴 琦

(天津市海河医院，天津300350)

结核病严重影响人类健康，抗结核药物的出现使结核病得到有效控制，但近10年，结核病疫情迅速回升，尤其耐药结核病的流行，为结核病疫情的控制带来更大的挑战。有研究［1，2］表明，结核分枝杆菌菌壁缺失变异形成L型后可长期潜伏于宿主体内导致结核病复燃。同时有研究［3］表明，结核分枝杆菌L型是导致结核菌耐药的原因之一。本研究观察了结核分支杆菌L型的诱导及其对抗菌药物的敏感性。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 结核分枝杆菌菌株 由标准结核分枝杆菌H37Rv菌株以比浊法稀释成1亿个菌细胞/mL的菌液备用。

1.2 培养基 由美国BD公司提供的960培养基作为结核分枝杆菌诱导培养基，按照文献［4］配制培养基作为培养L型菌的非高渗培养基。用蒸馏水分别稀释抗结核药物利福平、异烟肼、乙胺丁醇的药物原粉(Sigma公司)并加入BD960培养基，使其在每毫升培养基内的终浓度分别为:0.05、0.1、0.2 μg利福平，0.01、0.04、0.08 μg 异烟肼，1、2.5、5 μg 乙胺丁醇。并用蒸馏水稀释抗菌药物原粉分别加入罗氏培养基及非高渗培养基内，使药物最终的质量浓度分别为:4 μg/mL 链霉素、0.2 μg/mL 异烟肼、40 μg/mL 利福平、2 μg/mL 乙胺丁醇、30 μg/mL 卡那霉素、1 μg/mL 对氨基水杨酸、40 μg/mL 卷曲霉素、3 μg/mL 氧氟沙星。

1.3 L型菌判定标准 结核分支杆菌L型菌株为煎蛋样菌落，在高倍镜下为圆球、卵圆或不规则形态，半透明或不透明，单个或链状排列，沉于瓶底，不运动，不粘附瓶壁。抗酸染色见结核分支杆菌L型细胞为抗酸染色阴性，革兰染色可见体积较小的L型细胞呈革兰阴性，体积较大的L型细胞则为革兰阳性。

1.4 结核分枝杆菌L型的诱导与分离 将结核分枝杆菌接种于含不同浓度的异烟肼、利福平、乙胺丁醇的BD960液体培养基，置温箱37℃培养10 d后行抗酸染色，显微镜高倍镜下观察L型形成情况。之后用0.22 μm孔径滤菌器过滤培养物，将滤过物接种于不含任何药物的非高渗培养基内37℃培养并逐日观察L型生长情况。L型密集生长(14～20/d)后，取培养物传3代培养后作革兰染色、抗酸染色后镜检。同时将结核分枝杆菌接种于不含药物的BD960液体培养基内，置温箱37℃培养10 d后行抗酸染色，显微镜高倍镜下观察细菌型及L型形成情况。取培养物接种改良罗氏培养基置温箱内37℃分离培养。

1.5 结核分枝杆菌L型对抗菌药物的敏感性检测将结核分枝杆菌细菌型菌液及其L型的传代纯培养物分别接种于含不同抗菌药物的罗氏培养基及非高渗培养基内，肉眼及显微镜观察结核分枝杆菌及其L型的生长情况，并用比例法判断结核分枝杆菌细菌型及L型的药物敏感性。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌L型的诱导形成 培养10 d后，显微镜高倍镜下观察，0.05 μg 利福平、0.01 μg异烟肼、1 μg乙胺丁醇培养基内均未见L型菌形成，但可见大量细菌型生长;而其他浓度药物培养基内均可见L型菌形成，同时均可见有细菌型生长，其中 0.2 μg/mL 利福平、0.08 μg/mL 异烟肼、5 μg/mL乙胺丁醇的药物培养基内的L型菌数量最多。0.1、0.2 μg/mL 利福平，0.04、0.08 μg/mL 异烟肼，2.5、5 μg/mL乙胺丁醇培养基的滤过液有典型油煎蛋样菌落，显微镜下可见为L型菌生长，未见细菌型生长。高倍镜下可见L型结核分枝杆菌为圆形、短杆形、不规则形，革兰氏染色阴性;短杆形革兰氏染色为阳性，抗酸染色为淡染。

结核分支杆菌在不含抗结核药物的BD960液体培养基中培养3 d后肉眼可见培养基微混浊，10 d后显微镜高倍镜下可见细菌型大量生长，未见L型细胞。涂片抗酸染色可见典型形态的抗酸杆菌，接种改良罗氏培养基培养7～10 d后可见结核分支杆菌菌落生长。

2.2 结核分枝杆菌L型对抗菌药物的敏感性 结核分枝杆菌细菌型在含有上述不同抗菌药物的罗氏培养基内培养14 d后均未见细菌型生长，但含有链霉素的培养基内可见L型形成，培养30 d后均未见细菌型及L型生长。结核分枝杆菌L型在含有链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、对氨基水杨酸的非高渗培养基内培养7 d后均可见其生长，而含有卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星的培养基内未见生长。

3 讨论

异烟肼、利福平、乙胺丁醇作为一线抗结核药物被广泛应用于抗结核治疗，对结核病控制起到积极作用，它们主要是通过干扰结核分支杆菌的核酸、脂肪或蛋白质代谢而对繁殖期的结核分支杆菌产生抑制作用［5］。结核分枝杆菌L型是细胞壁缺陷的结核分枝杆菌，通常认为细菌在干扰细胞壁肽聚糖合成或破坏细胞壁结构的抗生素等因素的作用下，可发生细胞壁缺陷和形成L型［6］。细胞壁缺陷造成细菌丧失了抗生素作用的靶位，因此可对干扰细胞壁合成的抗菌药物形成非遗传性耐药性［6］。本文结果显示，中高浓度的异烟肼、利福平、乙胺丁醇对结核分枝杆菌细菌型具有抑制和杀灭作用，同时可诱导结核分枝杆菌L型形成并且获得耐药性。提示结核分枝杆菌是容易发生细胞壁缺陷的细菌，其可在许多因素的作用下发生细胞壁缺陷变异和成为L型。与王和等［7］实验结果相比，低浓度抗结核药物不能对结核分枝杆菌的细菌型产生抑制和杀灭作用，也不能诱导形成结核分枝杆菌L型形成，有可能与抗结核药物的浓度低于其对结核分枝杆菌的抑菌浓度有关，这有待试验进一步证实。浓度升高后抗结核药物显现出对结核分枝杆菌的抑制作用，同时也导致L型形成，L型的产生使结核分枝杆菌形成对利福平、异烟肼、乙胺丁醇的耐药，这样不但可导致临床抗结核药物治疗无效，而且也可造成结核分枝杆菌在宿主体内潜伏存在和形成结核的潜在带菌者与传染源。

结核分枝杆菌L型可长期潜伏于宿主体内导致疾病进入慢性过程，在一定条件下可以返祖造成结核病复发。本文结果可见，结核分枝杆菌L型对氨基糖甙类、喹诺酮等抗菌药物敏感。胡忠义［8］报道结核分枝杆菌L型对链霉素、红霉素、氧氟沙星、诺氟沙星等抗菌药物均敏感，而对传统的抗结核药物利福平、异烟肼、乙胺丁醇不再敏感。张世馥等［9］、马筱玲等［10］经实验证实结核分枝杆菌转变为L型后致病性大为减轻，引起的症状与病理变化很不典型，在临床上容易引起漏诊与误诊。以上这些因素有可能导致结核分枝杆菌L型长期潜伏体内，并导致疾病呈慢性过程或复发、恶化。马筱玲等［11］经实验证实，结核分枝杆菌细菌型与L型之间能相互变换，L型菌在一定条件下可逐渐回复成典型分枝杆菌，这也说明结核分枝杆菌L型是结核感染过程中持续存在的一种型式。结核分枝杆菌L型与结核病复发、恶化有一定关系［12］。若在患者就诊时同时进行细菌型和L型培养，并对结核分枝杆菌L型培养阳性结核患者进行抗结核分枝杆菌L型治疗，对提高结核病治愈率，减少复治或复发可能有一定的帮助。

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