蛋白印迹技术的优化

李 涛，朱玉楠，韩延杰，王芳芳，贺雅静，曹承华，施中东，程相树，姬新颖，何 敏

（1 河南大学医学院 河南省抗体药物工程实验室，河南 开封 475004；2 河南护理职业学院 内科教研室，河南 安阳 455000）

蛋白印迹技术的优化

李 涛1，朱玉楠1，韩延杰1，王芳芳1，贺雅静1，曹承华1，施中东1，程相树1，姬新颖1，何 敏2＊

（1 河南大学医学院 河南省抗体药物工程实验室，河南 开封 475004；2 河南护理职业学院 内科教研室，河南 安阳 455000）

蛋白印迹是细胞和分子生物学研究中重要的一种实验技术。利用蛋白印迹技术可以检测细胞或组织裂解液中的特异性蛋白，特别是微量蛋白的检测，并进行定性及定量的分析。自1979年科学家发明了将蛋白质通过凝胶电泳移植到生物膜后，蛋白印迹技术得到了极大的发展，目前科学界有各种形式的印迹方法。我们就如何优化蛋白印迹提高成功率做一介绍。

蛋白印迹；蛋白；转印；SDS－PAGE

蛋白印迹（Western blotting）又称免疫印迹，是继DNA印迹［1］和RNA印迹［2］之后发展起来的一种重要的用于蛋白质分离及鉴定的实验技术。此项实验技术是利用蛋白样品中分子量的不同而将蛋白质分离，然后从SDS凝胶中将蛋白质转移到具有吸附作用的纤维膜上［3］，将含有蛋白的纤维膜放在有荧光标记的抗体中进行孵育［4］，最后得到被分开的蛋白的条带。蛋白印迹的敏感性主要取决于转印和抗体的结合能力等［5］。在操作过程中任何一个环节出现失误都会使蛋白印迹的敏感性降低。

1 细胞的培养和收集

蛋白印迹成功的关键是所得蛋白质量的高低［6］，高质量的蛋白质需要良好的细胞状态。具体方法有：①如果培养瓶中有细胞碎片，可把细胞低速离心（600g，6min），换新瓶继续培养。② 细胞自身会分泌一些生长因子，如果细胞状态不好，不必天天换液，否则，生长因子将丢失。③ 如果细胞生长较慢，可将血清浓度增加至15%。④培养瓶中的细胞密度要适宜，一般培养瓶中含有50%～70% 的细胞较易生长。

收集细胞的前一天给细胞换一次液，第二天细胞则处于对数生长期，此期的细胞含的蛋白量较多质量也最好。收集细胞后用1×PBS洗2遍，立即裂解或置－80℃冰箱进行冻存，时间不超过2周。

2 蛋白样品的处理

2.1 细胞的裂解

向收集的细胞中加入其4倍体积的细胞裂解液，按照50∶1的比例加入蛋白酶抑制剂，使其充分混合。用加样器反复吹打细胞，协助其充分裂解，冰置30min。将离心机温度降至4℃，12000r／min，离心10min，小心吸取上清置另一干净的EP管中。

2.2 蛋白浓度的测定

用BCA方法测蛋白浓度，具体操作步骤如下：①稀释标准品。见表1。②配制BCA工作液。根据所测的样品的数量，按照50∶1的比例将A液和B液混合均匀，冰置待用。③将A～G的标准品和待测蛋白各吸取25μL加入96孔板中。④加入200μL的A、B混合液，混合均匀，置37℃恒温箱中30min。⑤用酶标仪在560nm处测吸光度。⑥根据吸光度绘制标准曲线，计算蛋白浓度。

表1 标准品稀释表

2.3 蛋白样品的变性

进行蛋白印迹实验时，所需的蛋白质是变性的［7］，因此要加入5×SDS－PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）缓冲液和1×SDS－PAGE缓冲液，使同一组的样品在相同的体积内含有相同含量的蛋白。之后煮沸5min，冰置1min，4℃，12000r／min，离心5min。

3 SDS－PAGE胶的配制

3.1 凝胶配制

将凝胶装置、玻璃板、梳子等清洗干净，并用双蒸水冲洗，晾干后备用。将一套玻璃板叠放整齐后加入凝胶装置中，并固定，以避免漏胶，向玻璃板中加入双蒸水检验装置是否漏水（约10min）。配制10mL 120g／L分离胶，混合均匀后，快速加入玻璃板中，避免气泡产生，加至距梳子齿1cm的地方，小心地用双蒸水加满，使胶面保持较平整，置37℃恒温箱中使之凝固。配制3mL 50g／L浓缩胶，混合均匀后，加入分离胶的上面，加满后，将梳子小心地插入玻璃板中，置37℃恒温箱中或常温凝固。胶凝固后，加入蛋白电泳缓冲液，待用。

3.2 注意事项

①按顺序加入凝胶的各个成分，充分混合均匀，否则会影响条带的形状。②玻璃板内的凝胶不要有气泡，如果有气泡产生，可用洗耳球轻轻敲打玻璃板将气泡赶出。③两手持梳子的两侧边缘，均匀的将梳子拔出，否则梳子孔会倾斜，在拔梳子的过程中如果梳子孔出现倾斜，用细的注射器针头拨正即可；④凝胶要现用现配，如果放置时间长，凝胶会发生收缩而影响条带的质量。

4 电泳和转印

4.1 垂直电泳

在电泳装置的正负极加入电泳缓冲液后，将处理好的蛋白样品小心加入加样孔中，同时一个孔加入3μL蛋白 Marker作为对照。打开电源，调电压至80V，连接电泳装置，蛋白样品首先在浓缩胶中被压缩，当蛋白样品进入分离胶时，将电压调至120V，目的是根据蛋白分子量的不同使蛋白样品分开。当蛋白样品跑到分离胶的底部时，可以切断电源。

垂直电泳要注意：①正极的电泳液要漫过内侧的玻璃板。②加样器吸取样品时不要有气泡，加样时不可太快，否则会使样品溢出，影响上样的一致性；③加不同的样品时，要换加样器针头，或将加样器在外电泳槽中洗涤3次，以免交叉污染。

4.2 转印

当样品跑到胶的底部时，要及时转膜，放置的时间不可太长，没有电流通过时，蛋白在凝胶中容易发生弥散。转膜分干转和湿转，我们一般用的是湿转。转膜时，转膜夹子的黑面朝下（默认为负极），从下到上依次为：1层海绵 —3层滤纸 — 凝胶 —PVDF膜—3层滤纸 —1层海绵。

具体方法为将跑完样品的玻璃板卸下，清水冲洗电泳液，用尺子沿玻璃板的边缘将玻璃板撬开，注意不要将胶弄破。用试管盛取少量转膜液冲洗胶的表面，将3层滤纸重叠好，用转膜液浸湿后压为1层。左手持带有胶的玻璃板（此时胶上一定要保证有一定量的转膜液，以便和滤纸吸附），右手持擀压好的滤纸，将滤纸的边缘与胶的边缘对齐，将滤纸贴在胶上，左手将玻璃板翻转，将胶从玻璃板上剥离下来，此时滤纸和胶会落在左手掌中，利用此种办法可以保证胶不会损毁。将滤纸向下置海绵上，左手轻压胶上的Marker部位，右手持小试管在胶上轻轻地擀压，以赶走滤纸和胶中间的气泡。在胶上均匀的铺1层转膜液，将处理好的PVDF膜用镊子夹住沿胶的一边，轻置胶上，用上述同样的方法将胶和PVDF膜之间的气泡赶走。在PVDF膜上铺上1层转膜液，将另外3层滤纸擀压为1层后轻置PVDF膜上，用同样方法赶走2层之间的气泡。盖1层海绵，夹紧，黑色面朝向负极放在转膜槽中，进行转膜。一般用恒流400mA，1～1.5h即可。

转膜注意事项：①甲醇浸泡PVDF膜1min，加入适量的转膜液置摇床10min，使膜充分活化。②滤纸、凝胶、PVDF膜的大小一致，否则会影响电流的通过。③2块海绵要用转膜液浸湿。④转膜液4℃存放，温度过高会影响转膜效果。⑤转膜时正、负极不要放错，蛋白质带负电，要保证凝胶靠近负极，PVDF膜靠近正极；⑥新配的转膜液，转膜时间1h，用3次以上，转膜的时间要相应延长至1.5h；⑦凝胶不分正反面，PVDF膜的正面为紧挨着凝胶的一面。

5 免疫反应和显影定影

5.1 免疫反应

将膜正面向上置大小适合的玻璃皿中，清水轻涮2遍，后用封闭液（TBST加入50g／L的脱脂奶粉）常温封闭1h。封闭抗体前用TBST将PVDF膜洗5min。根据需要可把膜剪开，以便封不同的抗体。封一抗时要让膜完全浸泡在一抗溶液中，封好后常温置摇床1h，低速，1～2挡以便一抗和目的蛋白充分结合。一抗在常温下可以封闭3h，也可以4℃过夜。

将封过一抗的膜用TBST涮洗3遍（5min／遍），涮洗时摇床调至6～7挡，洗膜时水平摇床，使膜在玻璃皿中受力一致，膜的各个部位洗的比较均匀。旋转式摇床，膜的两边受到的转速较大，中间的转速较小，易造成膜的两边洗的较重，中间洗的较轻，所得误差较大。

二抗稀释液为TBST加入5g／L的脱脂奶粉配制而成。常用的二抗有鼠二抗、兔二抗、山羊二抗等。同封一抗相同，室温，置摇床1h，以保证二抗能与一抗充分结合。用TBST涮膜后洗3遍（7min／遍），摇床调至6～7挡。

注意事项：①洗膜时，保证一张膜一个玻璃皿，否则膜之间会发生摩擦，把结合的抗体磨掉。②洗膜时最好在水平摇床上进行。③膜的两端一定要保证有一小段膜是空白的，这样既便于夹膜，又可对里面的蛋白起保护作用。④在夹取膜时尽量不要夹有蛋白的地方。

5.2 显影定影

根据膜的大小配制发光剂（稳定剂和增强剂按1∶1的比例配制）。将膜的正面置废胶片上，将发光剂均匀地涂在膜上，反应40～50s后将膜置吸水纸上吸除多余的发光剂，用保鲜膜将膜包好，正面向上固定在暗盒内。在暗室内将显影液和定影液分别置容器内，取出胶片，右下折角作为标记，将胶片置暗盒内，根据条带的强弱调整曝光的时间，一般从5s～10min。胶片首先置显影液中1min，清水冲洗，后置定影液中1min，清水冲洗，吹风机吹干胶片，留以分析。

曝片时注意事项：①涂发光液后，要迅速将胶片压在膜上，因为发光液的发光时间成抛物线的形式，最好在其发光刚起步时压上片子，使曝出来的条带没有背景色。②在显影和定影时需轻轻晃动胶片，尽量拿胶片一角，手指不要划伤胶片，以免影响结果。

6 结论

蛋白印迹是一种检测蛋白的技术手段。此技术不断向前发展，目前在转印、免疫检测方面取得了突破性进展，双转印法［8］、组织切片转印［9］、天然电泳［10］、网格式免疫转印［11］、多重抗原印迹［12］等转印技术的出现给蛋白印迹的发展拓宽了思路。尽管新型蛋白印迹的发展十分迅速，但是基础的免疫印迹在细胞和分子生物学的研究中却十分普遍。通过上述对蛋白印迹每一操作步骤的优化，能更容易、更直接的了解蛋白印迹的精髓所在，熟练每一操作步骤的关键及注意事项，以便能在短时间内掌握操作要领并成功得到所要的结果。

7 溶液配方

Western Blotting中用到液体的配方：①1×PBS Buffer（1L，pH＝7.4）：NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO41.42g；KH2PO40.27g。②1×细胞裂解液（1L）：HEPES 4.766g；NaCl 8.766g；MgCl22.033g；体积分数为5%Triton ×－1005mL；SDS 1g。③1×一抗稀释液（10mL）：BSA 0.1g；NaN30.01g；1×PBS 10mL。④ 5×SDS－PAGE Buffer（10mL）：Tris－Hcl（pH ＝6.8）0.6mL；体积分数为50%甘油 5mL；100g／L SDS 2mL；β－巯基乙醇0.5mL；10g／L 溴酚蓝 1mL；ddH2O 0.9mL。⑤1×SDS－PAGE电泳缓冲液（1L）：Tris 3.03g；Glycine 18.77g；SDS 1g。⑥ 1×转膜缓冲液（1L）：Glycine 11.25g；Tris 2.375g；SDS 0.37g；甲醇200mL；ddH2O 定容至1L。⑦1×TBST溶液（1L）：Tris 12.114g；NaCl 8.8g；ddH2O 800mL，用浓HCl调至pH＝7.5，定容1L，用时再加入吐温－20至体积分数为0.5%。⑧ 显影液（500mL）：dH2O 365.25mL；A 液 125mL；B 液 5.1mL；C 液4.875mL。⑨ 定影液（500mL）：dH2O 363.5mL；A液125mL；B液11.5mL。

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［责任编辑 姬 荷］

The optimization of Western blotting

LI Tao1，ZHU Yunan1，HAN Yanjie1，WANG Fangfang1，HE Yajing1，CAO Chenghua1，SHI Zhongdong1，CHENG Xiangshu1，JI Xinying1，HEmin2＊（1.Henan Provincial Key Engineering Laboratory for Antibody Medicine，School of Medicine，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Henan Vocational College of Nursing，Anyang，Henan 455000，China）

Western blotting is an important test technique used in the researching cell and molecular biology.By using the western blotting ，researchers can detect special proteins，particularly those that are of low abundance，from the complex mixture of proteins extracted from cells and tissues，and then make qualitative and quantitative analysis.Since scientists invented the protocol for protein transfer from an electrophoresed gel to a membrane in 1979，protein blotting has gained great developments.Now，in scientific community there are all kinds of means to transfer.So this paper describes how to optimize western blotting to improve the success rate.

Western blotting；protein；transfer；SDS PAGE

Q51

A

1672－7606（2014）02－0141－04

2014－01－25

国家自然科学基金面上项目（81071327，81270142）；河南省科技厅国际合作项目（11430051026）；河南省科技厅重点攻关项目（112102310269）。

李涛（1964年－），女，陕西蒲城人，实验师，从事分子生物学的教学和科研工作。

＊通讯作者：何敏（1964－），女，河南林州人，副教授，从事分子生物学的教学和科研工作。