超声法提取栾树干花中总黄酮的正交实验

袁 琦，蒲晓辉，陈毛芬，陈 鑫，李 哲，竟香艳，周云丰，崔丽丽

（河南大学 药学院，河南 开封 475004）

超声法提取栾树干花中总黄酮的正交实验

袁 琦，蒲晓辉＊，陈毛芬，陈 鑫，李 哲，竟香艳，周云丰，崔丽丽

（河南大学 药学院，河南 开封 475004）

目的对超声提取法提取栾树干花中总黄酮的工艺进行优化。方法利用超声法提取栾树干花中的总黄酮，考察乙醇浓度、料液比、超声时间3个因素对总黄酮得率的影响，通过单因素和正交试验确定了提取的最佳工艺条件。结果最佳提取工艺条件为体积分数70%乙醇、料液比1∶30、超声时间90min。结论工艺重现性好，对进一步的研究开发有比较好的参考价值。

栾树干花；总黄酮；正交实验；超声提取

无患子科植物栾树，俗称黑叶树、木栏牙（河南）［1］。《神农本草经》记载，栾树干燥的干花，又名栾华，味苦，性寒，无毒，归肝经。栾树干花药理作用的发挥与其所含的化学成分密不可分。研究［2］发现，其化学成分主要含：胡萝卜苷（I）、木犀草素（IV）、黄酮类化合物等。具有清肝明目、消肿止痛的功效。主要用于治疗目赤肿痛、多泪、眼角溃烂。多与黄连合用，清热解毒，以达到消除目赤火热的功效。有关栾树干花中总黄酮提取方法的研究较少［3］。为更有效的开发和利用药材资源，充分提取栾树干花中所含的总黄酮成分，遂采用正交设计的方法进行了提取工艺的研究，以期为进一步的开发利用提供参考。

1 仪器试剂与样品

1.1 仪器试剂

紫外可见分光光度计UV－1600（北京瑞丽有限公司）；AS3120超声波清洗器（天津奥特塞恩仪器有限公司）；SHB－III循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；芦丁（中国药品生物制品检定所）；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 样品

栾树干花（采于河南大学金明校区），自然风干，粉碎，装袋备用。

2 超声法提取栾树干花中总黄酮的测定方法

2.1 显色试剂以及测定波长的选择

本法选用NaNO2－Al（NO3）3－NaOH作为显色剂［4］，此法显色后溶液澄清，吸光读数稳定，故用50g／L－ NaNO2－ 100g／L － Al（NO3）3－40g／LNaOH作为显色体系。对2份样品和芦丁对照品显色后，在250～600nm的范围内紫外扫描确定吸收光谱，芦丁对照品λmax＝510nm处，样品提取液的λmax＝507～510nm，故选择在50g／LNaNO2－100g／L－Al（NO3）3－40g／LNaOH 显色后在510nm处测定吸光度。

2.2 栾树干花总黄酮的超声波提取及含量测定

将干燥的栾树干花粉碎，称取1.0g栾树花干粉于锥形瓶中，分别在不同的超声时间、料液比、乙醇浓度的条件下进行提取；抽滤，将提取液过滤、定容于50mL容量瓶中，即得供试品溶液。精密量取1mL供试品溶液于10mL容量瓶中，同“2.1”所述操作，并根据线性回归方程计算栾树干花总黄酮得率。

2.3 标准工作曲线的绘制

精密称取0.01051g芦丁对照品，置于50mL容量瓶中，加入体积分数为70%乙醇定容，摇匀即得标准液。精密量取已制备的对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL，分别置于10mL容量瓶中，各加入50g／L亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加入100g／L硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加入40g／L氢氧化钠溶液4mL，再用体积分数为30%乙醇稀释至刻度，摇匀，以相应的试剂溶液作参比，于510nm处测定吸光度。（如图1）以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C为横坐标，得回归方程为Y ＝0.1159 x－0.0091（R2＝0.9993），芦丁在浓度0.01051～0.07357g／L范围有较好的线性。

图1 芦丁标准溶液浓度

2.4 精密度实验

精密吸取芦丁标准品溶液5mL置10mL容量瓶中，加体积分数为30%乙醇定容至刻度，再从中吸取3mL置另一10mL容量瓶中，加50g／L NaNO2溶液0.3mL摇匀，放置6min；加100g／LAl（NO3）3溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加40g／L NaOH溶液4mL，再用体积分数为30%乙醇液稀释至刻度，摇匀。在510nm处重复测定5次，得吸光度平均值为0.364，RSD 为0.19%。

2.5 重复性实验

分别精密称取栾树干花5份，置于锥形瓶中超声30min后，抽滤，定容于50mL容量瓶中，再从待测液中抽取1mL于10mL容量瓶中，按“2.1”项下操作，摇匀后在510nm处测其吸光度，得黄酮含量的平均值为1.760，RSD 为0.82%。

表1 精密度实验结果

表2 重复性实验结果

2.6 栾树干花加样回收率实验

精取栾树干花粉末0.5g，共3份，分别加入高、中、低不同浓度的芦丁对照品，置于锥形瓶中，加入体积分数70%乙醇30mL，用超声波震荡萃取黄酮30min，抽滤，定容到50mL容量瓶中，加入50g／L亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加入100g／L硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，放置6min；加入40g／L氢氧化钠溶液4mL，再用体积分数为30%乙醇稀释至刻度，摇匀后在510nm处测其吸光度，每个浓度重复测定3次，得出芦丁的回收率及相对标准偏差（表3）。

表3 回收率实验结果

3 栾树干花中总黄酮测定的正交实验

3.1 单因素实验

选取超声时间、料液比和乙醇浓度3个可能影响提取效果的因素做单因素实验，以总黄酮得率为考察指标来确定各因素的合适范围。考察某一因素对栾树干花总黄酮得率的影响时，固定其他因素及水平。

3.1.1 超声时间对总黄酮提取量的影响

控制其他因素不变，从表4可以看出，随着超声时间的延长总黄酮的提取量先上升后下降，在60min时总黄酮的提取量值最高，随后再增加溶剂用量其提取量反而减小。考虑到时间太短不足以使栾树干花中总黄酮类物质完全析出，时间若过久则又会使提取出的总黄酮类物质分解。因此，超声时间选取60min左右为宜。

表4 超声时间

3.1.2 料液比对总黄酮提取量的影响

控制其他因素不变，一般来说，溶剂用量越大对黄酮类物质的溶解能力越强，越有利于黄酮类物质的扩散，提取效果越好。实验得知，总黄酮提取量开始时随着料液比的增大而增大，料液比在1∶30时总黄酮的提取量值最高，随后再增加溶剂用量其提取量反而减小。因此，料液比选取1∶30左右为宜（结果见表5）。

表5 料液比

3.1.3 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

控制其他因素不变，考察乙醇浓度对栾树干花总黄酮提取量的影响，（结果见表6）。由表6可知栾树干花总黄酮的提取量开始随着乙醇浓度的升高，在乙醇浓度达到体积分数60%时，总黄酮的提取量到最大值，之后随着乙醇浓度的增加其提取量又逐渐变低，主要原因是乙醇浓度不同，极性也不同，体积分数为60%的乙醇极性与黄酮类物质的极性相似［5］，随着乙醇浓度的升高，一些脂溶性物质的溶出增加，影响了黄酮类物质的浸出。

表6 乙醇浓度

3.2 正交实验

在单因素试验的基础上，确定超声时间、料液比和乙醇浓度3个因素进行正交试验以总黄酮得率为考察指标来确定提取栾树干花总黄酮的最佳工艺条件。

表7 因素水平设计

表8 L9（33）正交实验设计及结果

表9 方差分析表（%）

正交实验结果表明，超声时间对栾树干花总黄酮的提取效果有显著的影响。醇浓度对总黄酮提取的影响较小，料液比对栾树干花总黄酮的提取效果几乎无影响［6］。由表8、表9可知，3个因素对总黄酮得率的影响大小依次为：超声时间A＞醇浓度C＞物料比B，提取栾树干花总黄酮的最佳工艺条件为A3B2C3即 浓度70%乙醇，料液比1∶30，超声时间90min。

3.3 最佳工艺验证实验

为进一步考察最佳工艺的稳定性和合理性，按优化的最佳工艺条件进行重复性试验3次，分别测定栾树干花总黄酮的含量，得出平均总黄酮含量以及相对标准偏差值。

表10 最佳工艺的验证实验（%）

4 结论与讨论

超声提取是一种提取效率较高的提取技术，超声提取栾树干花中的总黄酮。单因素考察了超声时间、料液比、乙醇浓度对总黄酮提取量的影响［6］，在此基础上进行正交实验，结果表明超声时间对提取率的影响最大。

最佳提取工艺如下，乙醇浓度70%，料液比1∶30，超声时90min。在此条件下，做3次平行实验，栾树干花总黄酮的平均提取率为1.955%。该方法省时，溶剂用量少，提取率高，且设备简单、操作简单方便，重现性好，对进一步工艺开发有较好的参考价值。

［1］杨小凤，付宏征，雷海民，等.栾树的化学成分［J］.药学学报，1999，34（6）：1716－1719.

［2］中国科学院植物研究所.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1985：54.

［3］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海：上海科学技术出版社，1999：554－558.

［4］李蓉，李小平，于生兰，等.超声法提取蜘蛛香中总黄酮的正交试验研究［J］.安徽农业科学，2008，36（25）：10943－10977.

［5］赵其国，黄国勤，黄海燕.鄱阳湖生态环境与可持续发展［J］.土壤学报，2007，44（2）：318－326.

［6］冯海燕，李向军，胡瑞省，等.超声法提取萹蓄总黄酮的正交实验研究［J］.河北科技大学学报，2011，32（6）：611－614.

［责任编辑 李武营］

Orthogonal test in extraction of total flavone from dried flowers of koelreuteria paniculata by ultrasonic method

YUAN Qi，PU Xiaohui＊，CHEN Maofen，CHEN Xin，LI Zhe，JING Xiangyan，ZHOU Yunfeng，CUI Lili（Pharmacy College，Henan Uuniversity，Kaifeng，Henan 475004，China）

ObjectiveThe research aimed to optimize the extraction technology of total flavone from dried flowers of koelreuteria paniculata by ultrasonic method.MethodsTotal flavone was extracted from dried flowers of koelreuteria paniculata by ultrasonic method.Teffects of three factors including ethanol concentration，soli dliquid ratio，ultrason time on the yield of total flavone were investigated.The optimum technological conditions of total flavone exaction were confirmed through single factor test and orthogonal test.ResultsThe optimum exaction technological conditions were as follows：70%ethanol，solid－liquid ratio of 1：30and ultrasonic time of 90min.ConclusionThis technology has good reproducibility and has better reference value for further technology development of total flavone.

dried flowers of koelreuteria paniculata；Total flavone；Orthogonal test；Ultrasonic extraction

R927.11

A

1672－7606（2014）02－0104－04

2013－12－26

河南大学2012年度大学生创新性实验计划项目（12NB0261）。

袁琦（1974－），女，河南 开封 人，硕士生导师，副教授，从事药物分析的教学及科研工作。