血液剪切力诱导的血管内皮细胞形态学变化和信号通路

陈满军，洪文娟，洪志鹏

(昆明医科大学第一附属医院，昆明650032)

近年来，对血管内皮细胞(VEC)的研究已从静态转移到模拟人体血液剪切力的动态上来。目前研究成果表明，剪切力把信号传递到VEC内引起细胞的反应，对血液凝固、纤维蛋白溶解、血管重建有重要意义。血液剪切力发生变化时，VEC会做出一系列应答，从而可能引发一些心血管疾病［1］。因此，通过对剪切力影响下VEC的形态和分子水平的研究，可为心血管疾病的预防、治疗及生物工程血管内皮细胞培养提供新的思路［2，3］。本文就剪切力和VEC的作用关系作一综述。

1 血液剪切力对VEC形态的影响

在体外静态培养的VEC融合成单层后整体成铺路石样排列，单个细胞呈三角形、椭圆形或多角形，细胞排列随意，无规律性［4］。当血液快速而单向地通过血管时，VEC在血液剪切力的作用下呈纺锤形或梭形生长，其长轴与血液流动的方向平行［5，6］。然而，在血液剪切力作用下，VEC 的这一特征性变化是通过肌动蛋白骨架重组、肌动蛋白微丝重新排列与剪切力的方向对齐一致而达成的。VEC的骨架系统是由微丝、微管、中间丝形成的网络与相关蛋白一起而构成的联合结构，而肌动蛋白是微丝的主要成分［7，8］。肌动蛋白网络是主要承受张力的细胞骨架成分，含肌动蛋白的微丝在细胞形状的确定中起主要作用［9］。剪切力作用下VEC细胞骨架的变化除改变其形态和排列外，还涉及其通透性、迁移和增殖以及生物活性物质的合成释放等系列细胞功能［10］。大量研究表明，剪切力通过激活一系列的力学感受器和信号分子形成网络信号通路对VEC和细胞骨架进行调控［11～13］。

2 血液剪切力对VEC力学感受器的影响

VEC通过细胞膜上的力学感受器来感受血液剪切力的变化，把机械信号转化为化学信号，实现对VEC和细胞骨架的调节。近年来的研究认为，细胞膜上的力学感受器主要有以下几类。

2.1 整合素 整合素是一类跨膜蛋白受体家族，连接细胞外基质(ECM)与细胞骨架，由α和β两个亚单位组成，两个亚单位的胞质面对于整合素实现整个分子功能有重要作用。整合素介导的黏附或分子集聚，导致酪氨酸磷酸化。而局部黏着斑激酶(FAK)C端被称为局部黏附的靶序列，负责FAK与整合素的结合［14］。FAK能与许多其他的信号分子和结构蛋白结合，如衔接蛋白(c-Src)、细胞骨架蛋白(裸蛋白和辅肌动蛋白-α形成黏附斑复合物(FACS)，激活触发了一系列的第二信使酶链反应;或者直接激活丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)联级反应，促进内皮细胞的生长［15］。

2.2 受体酪氨酸激酶(RTKs)RTKs可分为20个亚科。RTKs有一个跨膜域，它在结构上提供了锚定受体位点负责酪氨酸磷酸化。RTKs可以感受血液剪切力，触发单体二聚作用改变在细胞膜上的构象［16］。酪氨酸激酶被激活使得内皮细胞一氧化氮合成酶(eNOS)促进一氧化氮(NO)产生;另外，RTKs家族中的PDGFRa作用位点在Y720，通过结合 Shb、Shf、Grb2、SHP-2 等蛋白激活 Rac/Ras通路使得细胞骨架重排［17］。

2.3 离子通道 各类型的离子通道也被认为是VEC对剪切力的力学感受器，在剪切力作用下通道被激活、开放。研究显示，许多离子通道是剪切力反应型的。例如，瞬时受体势离子(TRP)通道，是最大的离子通道家族之一，几乎所有的TRP通道都是由4个同质或异质的TRP亚单位组成。剪切力激活TRP后通过第二信使系统，如二酯酰甘油 (DAG)、多不饱和脂肪酸 (PUFA)、磷脂酰肌醇(PLC)、钙离子等传递来的信号［18～20］。

2.4 原纤毛 原纤毛是膜覆盖的棒状细胞器从细胞表面的凸出。原纤毛的核心由9个偶极微管通过微管中心进入胞质。原纤毛作为可能的剪切应力传感器，目前提出了两种机制解释初级纤毛如何识别剪切应力:一种机制是弯曲原纤毛感受剪应力诱发细胞骨架变形，原纤毛功能作为一个杠杆;另一个是弯曲的原纤毛激活离子通道，导致细胞外钙离子的流入［21～23］。

2.5 内皮细胞小窝(Caveolae) Caveolae位于VEC膜上，长度为50～100 nm。Caveolae能感受剪切应力的变化，是力传导感受器，并介导VEC钙信号和氧化还原信号［24］。一些研究发现，剪切力刺激下小窝附近会出现钙离子内流，使得eNOS快速的释放到细胞质中从而产生NO［25］。利用ATP成像技术，可以看到ATP释放集中在小窝区域［26］。另外，细胞内皮屏障功能依赖于Caveolae和肌动蛋白的结合［27］。

2.6 G蛋白 G蛋白是一个膜内侧的异型三聚体家族，该家族成员均与一类跨膜的受体蛋白直接作用，可引起膜脂质分解、产生环磷鸟苷(cGMP)以及引起钙离子的变化，进而引发细胞内的各种磷酸化过程。剪切力被证明在无蛋白受体区域能激活纯化G蛋白脂质体的重组，这也表明G蛋白本身也是一个剪切力感受器［28］。利用荧光共振实时分子成像技术，剪切应力引起缓激肽B2、G蛋白耦合受体(GPCRs)构象改变［29］。

3 剪切力对VEC作用的信号通路

研究表明，血液剪切力通过VEC剪切力感受器激活多条分子信号形成网络通路，包括有蛋白激酶C(PKC)、Rho家族小三磷酸鸟苷(GTP)酶家族、MAPK、FAK、NF-κB、c-Src、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等实现信号的转导。

3.1 PKC通路 PKC属于肌醇磷脂依赖性丝/苏氨酸激酶家族，作为一种重要的蛋白激酶和细胞内信号分子，可作用于多种底物。例如，细胞骨架蛋白等激活后直接引起该骨架蛋白的磷酸化，调节该细胞骨架蛋白的功能。PKC可通过增加黏着斑激酶的活性、促进整合素的碱性化及调节其他蛋白质的功能而促进黏着斑(FA)形成。当胞内二脂酰甘油(DAG)和钙离子水平的增加使PKC构象发生变化，使细胞表面有更多的整合素 β1。黏着斑蛋白是PKC重要的底物，结合后可促进更多的黏着斑蛋白形成;另一方面，PKC通过磷酸化Rho-鸟嘌呤分离抑制因子(GDI)，诱导调节Rac的活化和转位［30］。

3.2 GTP酶通路 GTP酶属于 Ras超家族，包括Cdc42、Rac、Rho。Rho结合二磷酸鸟苷(GDP)时无活性，结合GTP时恢复活性激活下游效应器增加细胞收缩、FA和应力纤维的形成。剪切力诱导RhoA的激活需要整合素ECM［7］，RhoA促进C-jun氨基末端激酶/激活蛋白-1(JNK/AP-1)、NF-κB、c-fos 的激活［31～33］。RhoA增加细胞收缩局部粘连，和肌动蛋白纤维形成张力;Cdc42调节丝状伪足的形成;Rac调节细胞膜板状伪足的形成。Rho/Rho依赖性激酶(ROCK)信号通路有重要的作用，ROCK位于肌动蛋白收缩核心，磷酸化肌球蛋白直接刺激收缩。ROCK1/2通过与RhoA结合引起应力纤维的形成。

3.3 MAPK通路 MAPK是激酶家族，包括有ERK、JNK、p38激酶。这些激酶通过苏氨酸/酪氨酸残基双磷酸化，进而激活调节细胞的生长分化。剪切力能激活MAPK，其中ERK有广泛的催化活性，是细胞对外信号反应的上游关键位点。剪切力变化能启动MAPK和NF-κB途径而引起后续的联级反应，ERK1/2依赖c-fos基因作用的靶基因是作为cAMP应答元件结合蛋白(CREB)启动子的cAMP应答元件(CRE)/AP-1 型元件［34］。

3.4 FAK FAK参与蛋白与蛋白的相互作用，是众多磷酸化的位点之一;它是一个理想的力学信号传到的锚定位点，与多个细胞表面受体和信号蛋白调节的对剪切力的应答。FAK现在被视为整合素和生长因子介导的信号通路一个集合点［35，36］。FAK通过SH2结构域与胞内信号分子非受体酪氨酸激酶(Src)和PI3K结合磷酸化，定位在肌动蛋白CSK区域，引导整合素介导的信号通路。从而激活触发了一系列的第二信使酶链反应;FAK或者直接激活MAPK联级反应。FAK激活的会造成 NF-κB磷酸化［37］。

3.5 NF-κB NF-κB 参与调控免疫学和炎症反应的基因表达，其活性可被IκB蛋白所抑制，不能进入细胞核内。NF-κB的激活是在翻译后水平进行的，主要通过其抑制物IκB降解实现的。剪切力可以使IκB磷酸化，蛋白酶迅速降解;NF-κB激活进入到细胞核内［38］结合于其靶基因的启动子或增强子上，迅速诱导靶基因mRNA的合成，从而诱导内皮细胞的凋亡和炎症因子的表达。肌动蛋白骨架的稳定与NF-κB 的激活有密切联系［39］。

3.6 PI3K/Akt通路 PI3K可以磷酸化肌醇磷脂肌醇环上的3'-OH，是一个包括许多脂质激酶的家族，包含有相对分子质量为85 kD的调节亚基和110 kD的催化亚基，PI3K激活后产生磷酸肌醇。Akt是一种Ser/Thr蛋白激酶，又称作PKB，是PI3K重要的下游分子;与磷酸肌醇结合后，会促进eNOS磷酸化和NO的产生［40］。通过研究，在剪切力的作用下PI3K能在15 s内激活［41］，同时也能使Akt在30 min内被激活维持6 h［40］。PI3K/Akt作用复杂，还能与下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促细胞生存等功能。

剪切力在VEC重构中起着重要的作用，使得VEC呈彷锤形或梭形生长，其长轴与血液流动的方向平行;VEC通过整合素、RTKs、离子通道、G蛋白、Caveolae等力学感受器，感知剪切力的变化;从而激活多条分子信号形成网络通路，包括有PKC、FAK、c-Src、PI3K、Rho小三鸟苷磷酸酶家族、丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)、NF-κB等，实现信号的转导，完成血管内皮细胞的重构。通过这些研究可以更好地理解循环系统血液动力学对VEC的影响，以及血液动力学因素参与的血管病理生理疾病，如高血压、血栓的形成、动脉粥样硬化等;同时，为组织工程设计构建人工血管和血管内皮化提供新的思路，为抑制肿瘤血管再生和抗粥样硬化药物寻找到新的靶点。

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