动物布鲁氏菌病实验室诊断与检测技术进展

程建国张富荣李小东陈有为孙建强张卫东

（1.巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古临河 015000；2.巴彦淖尔市职业技术学校，内蒙古临河 015000；3.乌拉特后旗乌盖苏木畜牧兽医工作站，内蒙古乌盖 015000；4.杭锦后旗动物疫病预防控制中心，内蒙古陕坝 015000）

动物布鲁氏菌病实验室诊断与检测技术进展

程建国1张富荣2李小东3陈有为1孙建强1张卫东4

（1.巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古临河 015000；2.巴彦淖尔市职业技术学校，内蒙古临河 015000；3.乌拉特后旗乌盖苏木畜牧兽医工作站，内蒙古乌盖 015000；4.杭锦后旗动物疫病预防控制中心，内蒙古陕坝 015000）

实验室诊断与检测对防治动物布鲁氏菌病（brucellosis）至关重要，其不仅可早期发现传染源和隐性感染动物，而且可检测动物通过疫苗免疫后产生的抗体水平，为合理制定免疫程序提供科学依据。实验室诊断与检测动物布鲁氏菌病常规方法包括：一般实验室检查、免疫血清学试验和病原学检查；高新生物技术包括：应用分子生物学技术检测及荧光偏振试验（FPA）。目前，我国对该病诊断的国家标准主要是依据细菌学和血清学检测结果来确定。其中免疫血清学试验是我国最常用的诊断与检测方法，该方法不仅可用于动物布鲁氏菌病的诊断与检测，而且还用于人感染布鲁氏菌病的诊断与检测。但是，这种诊断与检测方法在我国已经使用半个多世纪，并且存在着许多弊端，诸如：非特异性反应、假阳性、前带现象或动物自身免疫抑制等，因此还远不能满足对动物布鲁氏菌病的防控需求。探索动物布鲁氏菌病的实验室诊断与检测新技术以及高新分子生物学技术的研究进展，对于早期开展动物布鲁氏菌病的分子流行病学调查、早期确诊和防控均具有重要意义。

布鲁氏菌病；实验室；诊断；检测

动物布鲁氏菌病（brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌引起的人、畜共患传染病，其特征是生殖器官和胎膜发炎，临床表现为低热、关节肿胀、疼痛；可引起母畜流产、不孕；引起公畜睾丸肿胀、繁殖力下降；布鲁氏菌还可驻留于其他组织器官，引起不同程度的局部病灶等损害。人感染布鲁氏菌后，临床表现多样，有急性、亚急性和慢性之分。急性和亚急性可产生菌血症，主要表现为体温呈波型热或长期低热、寒战、盗汗、全身不适、关节炎、神经痛、肝脾肿大以及睾丸炎、附睾炎等，孕妇可能发生流产，有时可能累及多个器官，呈现不同程度临床体征；慢性多侵犯脊柱和大关节，通常无菌血症，但感染可持续多年。该病广泛存在于世界各地。我国目前在人、动物间仍有发生；而在我区，部分盟市的人间感染布鲁氏菌病则呈现上升趋势。按照《动物防疫法》，我国将该病列为二类传染病，自治区已将该病列为重大动物疫病，加以防控。

1 一般实验室检查

白细胞正常或偏低，淋巴细胞相对增多，有时可见异常淋巴细胞，少数病例血小板减少；细菌侵入机体后，可形成菌血症。急性期可出现血沉加快。

2 免疫学检测

目前，有诸多方法，归纳起来，不外乎血清中布鲁氏菌抗体检查和感染病料中是否存在布鲁氏菌病原体的检查两大类。动物感染布鲁氏菌一般于7～15d血清中可出现抗体（最早出现的抗体是IgM，然后是IgG和其他抗体）。检测血清中的抗体是动物布鲁氏菌病诊断和检疫主要手段，其方法众多，各有所长。因此，在实际工作中，最后选用一种以上的方法相互配合，以确保检验结果准确无误。

属于传统的试验方法，包括玻板凝集试验、虎红平板凝集试验（RBPT）、乳汁环状试验、缓冲平板凝集试验（BPAT）、试管凝集试验（SAT）。

SAT的优点是操作简便，判定容易，具有较高的诊断价值，一般不单独使用，常常与其他测试方法组合使用。如检出阳性后，再用补体结合试验进行实验室最后确诊。RBPT或BPAT多用于现场和大群初筛。

2.1.1 试管凝集试验与玻板凝集试验。牛、马、骆驼等大动物血清凝集价（或玻板凝集试验中相当的凝集价）达到1:100时，判定为阳性，1:50为可疑；羊猪、狗等血清凝集价:1:50为阳性，1：25为可疑。为了提高检出率，对羊血清可用12%的高渗盐水作为稀释液。可疑病畜3～4周后应采血重检，如仍为可疑，牛、羊可按阳性处理，猪、马则须视具体情况而定，若畜群以往既无本病存在，目前又无临床病例，且血检无一例阳性出现，则可判定为阴性。人血清凝集价1:100为阳性。

2.1.2 虎红平板凝集试验。取受检血清和虎红平板抗原各0.03ml，滴加于玻片上，混匀，4～10min内发生凝集者可判为阳性。虎红平板抗原是用虎红使抗原细菌染色成酸性（pH3.65左右）的缓冲平板抗原，可抑制引起非特异性反应的IgM和增强特异性抗体IgG的活性，其反应敏感、稳定，特异性优于试管凝集试验，并且，特异性抗体IgG一旦消失，该试验即变为阴性，因而，其试验结果与布鲁氏菌病转归有着明显的一致性。

2.1.3 乳汁环状试验。该试验常用于检测动物新鲜乳汁，操作简便，准确性较高，被广泛用于牛、羊布鲁氏菌病的诊断。

上述凝集反应，可出现由非特异性免疫球蛋白（例如因免疫接种而产生的IgM抗体）引起非特异性反应；另外，某些慢性病例产生不完全抗体，也不能呈现阳性反应，故应加以区别，以免误判。对于疑难的病例，还可选择抗免疫球蛋白试验、巯基乙醇试验、琼脂扩散试验或酶联免疫吸附试验等作为辅助诊断方法。

2.2 抗人免疫球蛋白试验（Coomb’s）

机体受抗原刺激后可以产生“完全抗体”与“不完全抗体”。不完全抗体虽可与相应抗原结合，但不出现可见的凝集反应。若将含有不完全抗体的人或动物血清球蛋白作为抗原，注射于另一种动物（常用家兔）制成抗此球蛋白（抗IgG、IgA及IgM）的抗体。再将此抗球蛋白抗体加入抗原与不完全抗体复合物中，即可出现可见的凝集反应。Coomb’s滴度1:400++及以上为布病诊

3.防止孩子太压抑，教会孩子适当宣泄不良情绪。人在精神压抑的时候，如果不寻找发泄机会宣泄情绪，会导致身心受到损害。生理学研究表明，人的泪水含有的毒素比较多，用泪水喂养小白鼠会导致癌症。可见，在悲伤时用力压抑自己，忍住泪水是不合适的。另外，在愤怒的时候，适当的宣泄是必要的，不一定要采取大发脾气的方法，可以采用其他一些较好的方法。例如：在盛怒时，不妨赶快跑到其他地方，或找个体力活来干，或者干脆跑一圈，这样就能把因盛怒激发出来的能量释放出来。

断标准。

2.3 补体结合试验（CFT）

CFT至今仍是布鲁氏菌病的重要诊断方法，是国际贸易指定用于牛、羊布鲁氏菌病实验室确诊的试验方法。但KlausNielsen认为CFT结论具有主观性，而且不能鉴别人工免疫和自然感染，实验条件复杂苛刻，不便向基层推广，不宜在现场进行。Searson提出改良的微量CFT法，相比于CFT具有更高的敏感性和特异性，且价廉、快速，适于自动化及易于标准化。一般发病3周后出现IgG抗体，由于此抗体能维持较长时间，故诊断慢性布病意义较大。该试验特异性高，滴度1:10++及以上可判为阳性。

2.4 变态反应检查

布病为第IV型传染性变态反应，一般在感染后的20—25d出现，故此法不易作早期诊断，主要用于绵羊、山羊、猪的慢性布病检测。其方法是将布鲁氏菌水解素0.2ml注射于羊尾根皱皱襞部或猪耳根部皮内，24h及48d各判定一次，若注射部位发生红肿，即可判为阳性。此法对慢性病例的检出率较高，而且注射鲁氏菌水解素后，无抗体产生，不妨碍以后的血清学检查。

2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）

用ELISA检测标本中的抗原或抗体是上世纪70年代初应用的一项技术。它较SAT和CAT敏感并且特异性高，操作方便，可用于确证和筛选试验。目前牛种和猪种布鲁氏菌的ELISA试验是国际贸易中的指定试验。猪布鲁氏杆菌和绵羊布鲁氏菌已有成熟的ELISA诊断技术ELISA分为间接ELISA 和竞争ELISA两类。大部分间接ELISA使用纯化的光滑型LPS作为诊断抗原，通常检测的是IgG类免疫球蛋白，敏感性极高，但同时假阳性也较高。这类假阳性通常是由小肠结肠耶尔森菌09的类属抗原成分所致，可由竞争ELISA所排除。

3 病原学检查

从患畜血液、骨髓、关节液、脑脊液、尿液及淋巴等组织中可分离培养出布鲁氏菌，该菌革兰氏染色阴性，呈球形、球杆形或短杆形，新分离者趋向球形，多单在，很少成双、短链或小堆状排列。不形成芽孢和荚膜，偶尔有类似荚膜样结构，无鞭毛不运动。急性期患畜血液、骨髓阳性率可达80%，关节液可达50%，慢性患畜阳性率较低。布鲁氏菌属共有6个生物种、19个生物型。我国流行的主要是羊布鲁氏菌病，其次为牛布鲁菌病。

布鲁氏菌营养要求高，在专用培养基上4～7d或更长时间生长。菌落形态湿润、圆形、表面光滑、无色透明；菌苔无色透明、湿润，用布鲁氏菌诊断血清与培养物做玻片和试管凝集试验，呈阳性反应。

4 分子生物学技术的应用

PCR（聚合酶链反应）方法可在物种和生物型水平上进行布鲁氏菌鉴定。这些技术要求最小的生物安全，并能在非常短的时间内提供结果。

4.1 多重聚合酶链反应（multiplex PCR）

Sreevatsan等运用多重PCR技术检测牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌。该实验采用两个种特异性靶序列：①流产布鲁氏菌的BCSP31K基因的一段序列；②牛分枝杆菌hsp65基因的一段重复序列，扩增后采用一种固相探测检测扩增产物。杜昕颖等针对布鲁氏菌外膜蛋白31kD、22kD和2a基因，设计引物进行多重PCR，经过实验优化，确定了多重PCR中引物的最适浓度。多重PCR灵敏度高于普通PCR、特异性强，能在同一反应管中同时检测多种病原体，准确性更高。

4.2 AMOS-PCR（abortus melitensis ovis suis-PCR）

AMOS-PCR是根据布鲁氏菌不同种的IS711序列位置的不同设计引物，即一个引物瞄定在IS711上，其他不同的引物分别选在与IS711插入序列邻近的单染色体DNA上，以代表种的特异性，通过扩增片段的大小来鉴别。Bricker等用AMOS-PCR方法对牛布鲁氏菌、猪流产布鲁氏菌及绵羊布鲁氏菌的不同变种在24h内即可进行分型，并能区分疫苗株和野毒株，从而为早期诊断和预防提供了科学依据。

4.3 巢式PCR

唐莉娟等根据GenBank中布鲁氏菌的DNA序列，针对布鲁氏菌膜蛋白Omp22基因设计引物进行巢式PCR，模板稀释倍数为1010，可扩增到最终目的条带，从而增加了检测的灵敏性和可靠性。Kim等则将多重PCR和巢式PCR相结合，特异性更强，敏感度更高。

4.4 实时荧光定量PCR

Redkar等研究设计了实时荧光定量PCR方法，特异性检测分析了流产布鲁氏菌、羊型布鲁氏菌和猪流产布鲁氏菌。Bounaadja等也用该法鉴定布鲁氏菌，同时与普通PCR进行比较，本法灵敏度高，可达到普通PCR的50～500倍，不与其他非布鲁氏菌发生交叉反应，但可与普通PCR用相同的引物，操作简单快速，易推广，不易产生污染，是目前检测动物布鲁氏菌病效果较好并且可重复进行检测的重要方法。

4.5 脉冲场凝胶电泳（PFGE）

PFGE是一种分离大分子DNA的方法，可以用来分离大小从25kb到10Mb的DNA分子。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子移动迅速接近，很难分离形成足以区分的条带，在PFGE中，电场不断的转换方向，相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难，因此，小分子向前移动的速度比大分子快。

PFGE技术特点就是用来研究细菌的分子流行病学特点，能够对全基因组进行分析，最终分析的DNA超过90%，可以从整个基因组的角度考虑菌株间的关系。用稀有位点的限制性内切酶进行酶切可以获得菌种某亚种特有的电泳图谱，是PFGE技术的显著优势。PFGE技术分型能力强，重复性好、分辨率高、结果稳定并易于标准化。

5 荧光偏振试验（FPA）

FPA是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子量大小成反比的特点，定量检测抗原或抗体的一种分析方法。FPA是利用荧光素经单一波长（蓝光）的偏振光照射后，能吸收光能并发射出相应的偏振荧光，其强弱程度与荧光分子的大小呈正相关。Gall D等用FPA检测牛种布鲁氏菌，并与其他血清学检测方法进行比较，认为FPA是检测牛布鲁氏菌最稳定的血清学方法。通过双盲实验证实FPA还可以区别牛种布鲁氏菌感染和疫苗株S19免疫接种。FPA省去了洗涤步骤，减少了馥郁，大量节省了检测时间，降低了检验费用，而且有较高的敏感度和特异性，是最有吸引力的牛种布鲁氏菌血清抗体检测方法。

综上所述，虽然布鲁氏菌检测技术已有了很大的发展，但是还没有一种单一的方法能适应任何情况下进行快速、准确检测

的布病诊断项目。布病的各种诊断技术具有不同的适用范围，而且各自都存在着一些缺点和局限性，因而不能相互取代。国家法定标准的检测手段仍以细菌学和血清学诊断为主，血清学作为动物布鲁氏菌病诊断的常规方法，但不足之处是检测依赖于体内的抗体水平，与其他抗体存在交叉反应而导致假阳性等；优点是快速、简便、费用低。以PCR为代表的分子生物技术不仅用于布鲁氏菌菌种的鉴定，还能反映基因间存在的差异。实践中通常需要根据检测目的来拟定检测策略，往往需要几种方法相互配合，才能取得较为科学合理的检测结果。选择原则通常是简便、敏感性高的方法进行初筛，以防漏检；以特异性高的方法进行确诊，以剔除非特异性反应、前带现象和假阳性。如首先以虎红凝集试验作为初筛，再以试管凝集试验作为确诊，或以间接ELISA作为初筛，以竞争ELISA作为确诊。未来随着检测技术的不断发展和完善，ELISA、PCR、PFGE、和FPA等高新技术方法，因其敏感性高、特异性强、检测时间短，即将成为动物布鲁氏菌病检测的重要手段。未来还将会有更先进的技术应用到动物布鲁氏菌病的诊断和预防中，使检测更加快速、简便和准确，最终为彻底控制和消灭动物布鲁氏菌病发挥更加积极的作用。

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