鸡传染性法氏囊病毒常用检测技术概述

2014-04-05赵青梅山西省平遥县畜牧中心031100

山东畜牧兽医 2014年10期

赵青梅（山西省平遥县畜牧中心 031100）

鸡传染性法氏囊病毒常用检测技术概述

赵青梅（山西省平遥县畜牧中心 031100）

鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种主要危害雏鸡的免疫抑制性传染病。本病发病率高，发生本病的鸡场，常常出现新城疫、马立克氏病等疫苗接种的免疫失败，这种免疫抑制现象常使发病率和死亡率急剧上升。因此快速准确地检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)，对正确诊断、预防鸡传染性法氏囊病，降低养殖户的经济损失十分重要。本文将就鸡传染性法氏囊病病毒常用的检测技术进行分类介绍。

1 鸡传染性法氏囊病毒分离

取病鸡的法氏囊或脾脏，研碎后加入灭菌生理盐水，制成混悬液，离心取上清液，加适量双抗，通过绒毛尿囊膜途径接种9～11日龄SPF鸡胚。3～5d后鸡胚出现死亡，胚体充血、出血、肝脏有斑点状坏死和出血斑。取绒毛尿囊膜或尿囊液与鸡传染性法氏囊病阳性血清进行中和试验鉴定，或在Vero细胞上连续传至第4代，接种后第5天出现明显的细胞病变。

2 电子显微镜直接检查鸡传染性法氏囊病病毒

取病死鸡法氏囊用4%戊二醛和1%锇酸双固定后，再按常规乙醉系列脱水，环氧丙烷过滤，618或812树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和棕檬酸铅染色做常规电镜标本，电子显微镜下观察，可见晶格状排列、近似六角形、二十面体立体对称的IBDV。

3 血清学方法

3.1 琼脂扩散试验(AGP) 琼脂扩散试验主要用于检测血清中的抗体或抗原。取病死鸡的法氏囊或肝脏，研磨制备成混悬液，与IBDV标准阳性血清进行AGP。

3.2 免疫荧光检测技术荧光抗体染色技术(FAT)是基于抗原抗体反应原理，将荧光染料如FITC标记到特异性抗体上，荧光抗体与病料中病毒或分离的病毒反应，通过荧光显微镜观察做出判断[1]，分为直接免疫荧光和间接免疫荧光，常用作初次诊断。

3.3 免疫电泳检测技术（1）对流免疫电泳技术(CIET)，是一种在免疫双扩散的基础上发展起来的一种加速了免疫扩散的检测技术，其灵敏、渐变准确迅速。（2）火箭免疫电泳技术(RIEP)，是一种在电场力的作用下，使得抗原通过含有抗体的琼脂凝胶时，与相应的抗体形成抗原抗体复合物，并在两者比例适当部位沉淀下来的检测技术。

4 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原或抗体吸附到固相载体上利用标记酶反应测定抗体或抗原含量的一种检测方法，该方法敏感特异、操作简便、易于重复，是目前最常用的一种免疫检测方法。吴红专等标记单抗M22制备了单抗ELISA试剂盒，大量临床样本的检测表明该试剂盒检测准确性与病毒分离鉴定结果基本一致。1981年Howie首次应用ELISA进行IBDV的检测，此法是检测IBDV的特异、敏感、快速和重复性好的一种方法。Marquardt等和刘源远建立了间接ELISA定量检测IBDV抗体。刚松堂等[2]建立了双抗体夹心法，此法灵敏度是AGP 的200倍。黄金海等[3]建立了免疫过氧化物酶单层试验( IPMA) 来检测鸡血清中IBDV抗体。伊岚等[4]建立了斑点—酶联免疫吸附试验(Dot-EL ISA) 检测鸡血清中IBDV 抗体，检出的阳性率为100%，具有特异性强、灵敏性高、重复性好、直观性强等优点，可用于IBDV母源抗体及鸡群接种疫苗后特异性抗体的检测。

5 单抗技术

Snyder等[5]最先对用单抗技术检测IBDV抗原进行系统研究，证明单抗技术不仅具有常规ELISA方法的各种优点，而且能够利用中和单抗区分不同的血清型和亚型。日本学者Nakamura等[6]利用聚苯乙烯微球联接单抗对IBDV抗原进行检测，结果更敏感、快速，室温下用玻片作凝集反应，5min便出结果，既可定性又可定量。Snyder等[7]还利用中和单抗免疫酶组化法直接检测到组织中IBDV的抗原漂移，并鉴别出了群特异性和型特异性中和位点。另外，Mundt等[8]利用单抗技术与其它方法相结合还从IBDV感染细胞中鉴定出该病毒的一种新蛋白成分VP5。T ure等[9]也利用单抗Do t-ELISA对不同毒株IBDV抗原检测进行了详细研究，并指出非中和性单抗可以和IBDV的各个毒株发生反应，而中和性单抗却不具备这一点，因此从抗原检测的角度看，前者更优于后者。王成明等[10]用其建立的中和单抗作双夹心ELISA对病鸡囊中IBDV的检出率为100%。刘滨东等[10]报道，他们建立的8株针对vp2的单抗中，有4株具有良好的诊断和治疗作用。陶素华等[11]报道，他们利用碱性磷酸酶-抗酶桥联酶标显色技术(APAAP)联接单抗对感染细胞的IBDV进行检测获得满意结果。随后又用同位素标记单抗对来源于6个省市的7株IBDV进行了抗原表位变化的测定[12]。

6 病毒中和实验

病毒与特异性血清作用后失活或部分失活，从而丧失或降低其对易感细胞的感染性，结合病理观察或荧光染色技术等作出诊断。

7 分子生物学检测技术

7.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术 PAGE技术是研究蛋白质的一种重要方法，它主要是利用蛋白质分子量的差异将不同的蛋白质在电泳介质中区分开，通过染色对目的蛋白作出鉴定。在IBD 的诊断中，此法不仅可检出病毒特异性蛋白，而且可以区分出毒株间的差异。

7.2 蛋白质印渍(Westernblot)技术 Westernblot是将PAGE与抗体标记技术结合起来对特异性蛋白质进行检测的一种先进方法。它不仅可能测得病毒蛋白的种类、分子量等特性，而且还可借助特异性抗体或单抗对病毒蛋白的免疫学特性进行研究。Fachey等[13]首先用此法对IBDV 的免疫原性进行了鉴定。

7.3 核酸探针技术核酸探针技术也叫核酸杂交技术，该技术是在特异性核酸片段上标记放射性同位素或生物素制备探针，利用分子杂交技术进行检测的一种诊断方法。是80年代发展起来的一种新的分子生物学诊断技术，90年代用于诊断IBDV。这种方法的最大优点是特异性强，灵敏度高，尤其适用于IBDV的早期诊断。

7.4 聚合酶链式反应(PCR)技术聚合酶链反应(PCR)具有高度灵敏、特异、快速等特点，能从仅含1个拷贝的样品中检出目的核酸，而且对被检样品预处理要求不高，因此特别适合于含毒量极少的感染组织诊断，包括早期感染的诊断。Davis等[14]最早将PCR技术应用于IBD的诊断，用PCR技术从未经纯化的污染囊和粪便中直接检出了IBDV。王永山等于1994年就正式报道了用反转录PCR (RT-PCR)检测IBDV的方法，可以检出10fg的病毒RNA。

7.5 荧光定量PCR技术荧光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR)，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。此定量方法的应用基础是Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性及双标记荧光探针的发现，它融合了PCR及DNA探针杂交优点，能直接检测PCR扩增过程中信号的变化，可对核酸进行相对及绝对定量。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物量，并且由此来推断模板最初含量。目前常用的TaqMan探针法相比较SYBR Green Ⅰ染料法更为特异准确。

[1] 秦爱建, 杨兰芬, 吴成昌. 直接荧光抗体快速检测新城疫病毒[J].中国畜禽传染病 ,1990,02: 26～27.

[2] 黄金海, 李健强, 伊岚. 免疫过氧化物酶单层试验检测鸡传染性法氏囊病病毒抗体的研究[J]. 中国畜禽传染病, 1997, 01: 10-13.

[3] 应承胜, 殷海成, 刚松堂. ELISA双抗夹心法检测IBDV抗原[J]. 信阳农业高等专科学校学报, 1999, 01: 11-14.

[4] 伊岚, 陈杰, 李健强. 斑点ELISA检测鸡IBD抗体方法的建立及其应用.中国兽医科技[J], 1999, 02: 25-26.

[5] D. B. Snyder et al., Avian Dis 32: 535～539.

[6] T .Nakamura et al., J . Virol. Methods, 1993, 46.

[7] D. B. S nyder et al., Avian Dis 1988, 32: 527～534.

[8] E. Mun dt et al., J. Gen er. Virol 1995, 76: 437～443.

[9] O. Tur e et al., Avian Dis 1993, 37(3): 647～654.

[10] 王成明等. 第六次全国禽病学术研讨会论文集[A]. 中国畜牧兽医学会禽病学会[C]. 广州. 1992, 258.

[11] 江青艳等.第七次全国禽病学术研讨会论文集[A]. 中国畜牧兽医学会禽病学分会[C]. 郑州:1994, 129～131.

[12] 陶素华等.第七次全国禽病学术研讨会论文集[A]. 中国畜牧兽医学会禽病学分会[C]. 郑州. 1994, 226.