紧密连接Occludin蛋白在大鼠脑出血致肠屏障改变中表达的变化
2014-04-04武国艳张继龙王智超汪连珍潘磊
武国艳，张继龙，王智超，汪连珍，潘磊
紧密连接Occludin蛋白在大鼠脑出血致肠屏障改变中表达的变化
武国艳，张继龙，王智超，汪连珍，潘磊
目的：研究紧密连接Occludin蛋白在大鼠脑出血致肠屏障改变中表达的变化。方法：健康成年雄性Wistar大鼠36只，随机分为脑出血组和假手术组，每组18只。脑出血组建立急性脑出血模型。HE染色观察空肠病理形态，免疫组化法观察肠粘膜紧密连接Occludin蛋白的表达。结果：15只大鼠脑出血造模成功；脑出血组大鼠空肠出现明显病理改变，紧密连接Occludin蛋白平均光密度低于假手术组（＜0.05）。结论：急性脑出血时，空肠组织出现病理改变，紧密连接破坏，肠粘膜紧密连接Occludin蛋白表达下降。
急性脑出血；肠屏障功能；Occludin蛋白
肠道被认为是机体应激时的中心器官，是多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的“始动”器官[1]。研究证实早期实行肠内营养，维持内脏血流稳定性及肠屏障完整性能明显降低MODS发生率[2]。因此，研究脑出血时肠屏障改变对临床脑出血的诊疗有极其重要的意义。研究证实，紧密连接Occludin蛋白能反映肠道紧密连接及屏障破坏的情况，其分布减少会导致肠屏障功能障碍从而导致疾病发生。本研究通过建立脑出血模型观察肠道Occludin蛋白表达变化，探讨Occludin蛋白在脑出血时肠屏障损伤中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠36只，体质量（240±20）g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.1.2 主要试剂 兔抗大鼠Occludin多克隆抗体购于英国Abcam公司；山羊抗兔IgG试剂盒及DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及造模 大鼠随机分为脑出血组和假手术组，各18只。2组均参照Deinsberger等[3]的方法制备脑出血模型，经胃管给予肠内营养。在实验过程中维持大鼠全身循环灌注、氧合稳定正常。
1.2.2 指标检测 各组大鼠清醒后，观察其行为改变。造模24 h后处死大鼠，取脑，同时开腹取空肠1 cm，4%甲醛固定。①行脑组织切片，判断是否脑出血造模成功。造模成功的大鼠进行空肠标本的相关检测。②HE染色，光镜下观察空肠病理形态。③过氧化物酶标记的链霉卵白素（streptavidin peroxidase，SP）法检测空肠Occludin蛋白表达。每张切片于200倍光镜下随机选取5个视野，应用彩色图文计算机图像处理系统采集图像，Image Pro Plus 6图 文软件分析系统测定光密度（optical density，OD）值。
1.3 统计学处理
采用SPSS 18.0软件处理数据，计量资料以（x± s）表示，配对 检验，＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物模型资料
脑出血组大鼠清醒后有15只出现拖步行走、肢体偏瘫、旋转爬行等行为改变。脑组织切片[4]，证实脑出血造模成功15只。假手术组大鼠均未出现上述神经缺损症状，脑内亦无血肿形成。
2.2 肠粘膜病理学改变
HE染色光镜下观察结果显示，假手术组大鼠空肠结构正常，小肠绒毛结构完整，呈高柱状上皮，间质无水肿。脑出血组大鼠空肠可见小肠部分绒毛肿胀破坏、部分脱落，固有层血管扩张充血水肿，炎性细胞浸润，少量柱状上皮坏死，肠腔炎性渗出[4]。
2.3 Occludin蛋白的表达变化
脑出血组Occludin蛋白分布不均，染色变淡；假手术组Occludin蛋白均匀一致分布于小肠上皮细胞连接处的顶端，呈很强的棕褐色信号，见图1。脑出血组肠粘膜Occludin蛋白OD值为（0.1876± 0.0072），假手术组为（0.2065±0.0152），前者低于后者（＜0.05）。
3 讨论
正常的肠屏障功能的维系依靠机械性屏障、菌群屏障、免疫性屏障的共同作用，其中以机械屏障最为重要。上皮细胞间紧密连接是构成机械屏障的结构基础，可防止细菌内毒素等大分子渗透到周围组织。上皮细胞的紧密连接是由Occludin蛋白、闭合小环蛋白ZO和膜相关蛋白参与组成，其中
本研究通过免疫组化方法检测Occludin蛋白的表达，发现脑出血组较假手术组明显减少（＜0.05），而脑出血组肠粘膜病理损伤明显较假手术组重，进一步说明Occludin蛋白的表达与肠粘膜损伤相关。
R741
A DOI 10.3870/sjsscj.2014.05.024
武汉市第一医院急诊科武汉430022
武汉市卫生局课题（No.【2011】99号）
2014-05-22
张继龙zhangjilong73@163. comOccludin蛋白是内皮细胞间紧密连接的主要功能蛋白[5-7]。实验证实内皮细胞紧密连接中Occludin蛋白的表达量越高，内皮的通透性越小[5]。也有研究表明，Occludin蛋白分布异常可导致肠上皮细胞旁路渗透性增加，紧密连接完整性遭到破坏，从而导致肠屏障功能障碍[8]。因而，对occludin水平的检测能反映肠道紧密连接及屏障破坏的情况[8,9]。
